王娟娟，施旭東，肖園園，張覓，隋俊，黃菁

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210000)

艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，是由HIV感染引起的危害性極大的傳染病[1]。HIV感染可導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行性減少，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值倒置，細(xì)胞免疫功能受損，易并發(fā)嚴(yán)重感染[2]。結(jié)核病及非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium, NTM)感染是其常見的機(jī)會(huì)性感染之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國結(jié)核病新發(fā)患者人數(shù)約86.6萬人，其中有1.8萬例新發(fā)HIV相關(guān)結(jié)核，HIV陽性人群中約有2 400人死于結(jié)核病[3]。機(jī)會(huì)性感染是AIDS相關(guān)發(fā)病率和病死率的主要驅(qū)動(dòng)因素，對(duì)其早期診斷和治療可顯著降低HIV/AIDS患者的病死率并提升生存質(zhì)量[4]。本研究通過回顧性分析南京地區(qū)HIV/AIDS患者分枝桿菌感染分布及耐藥情況，為臨床診斷和個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2017年1月至2020年7月南京市第二醫(yī)院感染科收治的1 012例HIV/AIDS患者為研究對(duì)象，其中，男795例，女217例，年齡(43.7±14.1)歲。所有HIV/AIDS患者均符合《艾滋病診療指南2018版》[1]?；仡櫺允占谢颊逤D4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以及各類標(biāo)本(包括痰液、灌洗液、全血、胸腹水、腦脊液和糞便等)的分枝桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果。同一患者相同標(biāo)本類型所培養(yǎng)獲得的菌株體外藥敏試驗(yàn)及菌種分型一致，則按1例計(jì)。

1.2試劑與儀器 改良羅氏培養(yǎng)基、分枝桿菌藥敏培養(yǎng)基、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基(珠海貝索公司)，質(zhì)控菌株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株(中國藥品生物制品檢定所)，分枝桿菌菌種鑒定(PCR-反向點(diǎn)雜交法)試劑盒、20×SSC緩沖液、10%SDS緩沖液、1 M檸檬酸鈉緩沖液(深圳亞能生物公司)，淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑(美國BD公司)；BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)儀、FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，ABI 7500型熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技公司)，恒溫雜交儀(深圳亞能生物公司)。

1.3方法

1.3.1分離培養(yǎng)及鑒定 參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行分離培養(yǎng)，陽性菌株用PNB、TCH鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌菌種初步鑒定。如果2種鑒別培養(yǎng)基上均無分枝桿菌生長，報(bào)告為牛結(jié)核分枝桿菌；如果2種鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長，報(bào)告為NTM菌群；如果PNB培養(yǎng)基上無分枝桿菌生長而TCH培養(yǎng)基上有分枝桿菌生長，報(bào)告為結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)。

1.3.2藥敏試驗(yàn) 用絕對(duì)濃度法。取培養(yǎng)陽性菌株，在細(xì)菌超聲分散儀上制備成1 mg/mL的菌懸液，稀釋成10-2mg/mL，取100 μL分別接種至2支對(duì)照培養(yǎng)基(中性改良羅氏培養(yǎng)基)和高低濃度含藥培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)4周。對(duì)照培養(yǎng)基上菌落生長良好的前提下，含藥培養(yǎng)基上無菌落生長，則報(bào)告敏感(S)；生長菌落數(shù)多于20個(gè)，則報(bào)告耐藥(R)；少于20個(gè)，記錄實(shí)際菌落數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)藥物種類包含鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素、對(duì)氨基水楊酸。

1.3.3分枝桿菌菌種鑒定 按照試劑盒說明書，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行前處理、待測(cè)標(biāo)本DNA提取、配制反應(yīng)體系后置于熒光定量PCR儀中擴(kuò)增。同時(shí)在體系中加入陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品DNA。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)30次；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)30次；68 ℃ 10 min。將菌種鑒定膜條、PCR產(chǎn)物及雜交緩沖液置于同一管中，沸水浴10 min，放入恒溫雜交儀59 ℃雜交1.5 h后洗膜，顯色，根據(jù)膜條特定位置顯色與否來判讀結(jié)果。陽性質(zhì)控品的膜條在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群位點(diǎn)和質(zhì)控位點(diǎn)顯色且其他位點(diǎn)不顯色，同時(shí)陰性質(zhì)控品的膜條只在質(zhì)控位點(diǎn)顯色視為實(shí)驗(yàn)有效，否則實(shí)驗(yàn)無效。

1.3.4CD4+T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 按照試劑盒說明書對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，處理后的標(biāo)本用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并用MultiSet軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))表示。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1分枝桿菌分離情況 1 012例HIV/AIDS患者共送檢2 415份標(biāo)本，分枝桿菌培養(yǎng)陽性357例，陽性率為14.78%。

2.2MTB和NTM的分離情況 分枝桿菌培養(yǎng)陽性的357例標(biāo)本中，除去122例未進(jìn)行菌種分型及體外藥敏試驗(yàn)的標(biāo)本，因同一患者相同標(biāo)本類型培養(yǎng)所獲得的菌株體外藥敏試驗(yàn)及菌種分型一致按1例計(jì)入，共除外84例，共獲得151株分離株，其中MTB 54例(35.76%)，NTM 97例(64.24%)，均以痰液標(biāo)本為主，分別占62.96%和41.24%，見表1。

表1 不同類型標(biāo)本MTB與NTM的分離情況

2.3NTM菌種的分布情況 97例NTM經(jīng)菌種鑒定，共獲得8種不同菌株，包括鳥分枝桿菌65株(分離率67.01%)，胞內(nèi)分枝桿菌13株(分離率13.40%)，堪薩斯分枝桿菌7株(分離率7.22%)，戈登分枝桿菌5株(分離率5.15%)，瘰疬分枝桿菌3株(分離率3.09%)，蘇爾加分枝桿菌2株(分離率2.06%)，蟾蜍分枝桿菌、龜分枝桿菌膿腫亞種各1株(分離率1.03%)。

2.4MTB和NTM的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 54例MTB中耐藥菌株共13例，總耐藥率24.07%；耐多藥2株，耐藥率3.70%，均分離自痰液；97例NTM中耐藥菌株共94例，總耐藥率96.91%。MTB和NTM總耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=89.118，P<0.01)，且其對(duì)不同藥物的耐藥率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 MTB和NTM對(duì)不同藥物的耐藥情況[n(%)]

2.5MTB和NTM感染者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的分布情況 54例MTB感染者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)中位數(shù)為91(44，156)個(gè)/μL，其中<50個(gè)/μL有20例(37.04%)，50～200個(gè)/μL有25例(46.30%)，200～350個(gè)/μL有7例(12.96%)，350～500個(gè)/μL有2例(3.70%)；97例NTM感染者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)中位數(shù)為32(6，104)個(gè)/μL，其中<50個(gè)/μL有51例(52.58%)，50～200個(gè)/μL有27例(27.84%)，200～350個(gè)/μL有15例(15.46%)，350～500個(gè)/μL有3例(3.09%)，>500個(gè)/μL有1例(1.03%)。

3 討論

HIV感染引起的免疫功能缺陷導(dǎo)致機(jī)體對(duì)諸多疾病易感性的增加是HIV/AIDS患者機(jī)會(huì)性感染的主要原因，也是HIV/AIDS患者死亡的主要原因[5]。中國是分枝桿菌感染的高負(fù)擔(dān)國家，艾滋病合并結(jié)核會(huì)加速艾滋病的進(jìn)程，而抗結(jié)核治療成功率低，病死率居高不下，這是雙重感染防治工作正在面臨的困難。

NTM是HIV/AIDS患者肺內(nèi)及肺外感染的重要病原體之一，引起肺部感染時(shí)臨床表現(xiàn)常與肺結(jié)核相似且對(duì)常用抗結(jié)核藥物有較高的耐藥性，容易被誤診為結(jié)核病或耐藥結(jié)核病，引起治療不當(dāng)，延誤病情。本研究中，分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為14.78%，稍低于上海市(19.19%)[6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，艾滋病患者的分枝桿菌培養(yǎng)陽性菌株中約50%為NTM[7]，本研究中，151例分枝桿菌分離株中，NTM占64.24%。黃莉莉等[8]發(fā)現(xiàn)南京地區(qū)2017年5月至2018年8月NTM分離率為15.5%，流行菌株為胞內(nèi)分枝桿菌(70.1%)，而本研究提示南京地區(qū)HIV/AIDS患者合并NTM感染時(shí)，主要是鳥分枝桿菌感染(67.01%)，但占比明顯高于四川地區(qū)(8/21)[9]，可能是標(biāo)本來源人群及地域差異所致。

郝賢斌等[10]報(bào)道HIV和MTB共同感染后造成死亡率升高的原因可能是MTB激活機(jī)體適應(yīng)性免疫和固有免疫，產(chǎn)生細(xì)胞因子和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)HIV的復(fù)制，病毒載量升高，CD4+T淋巴細(xì)胞大量被破壞。本研究中HIV/AIDS合并MTB感染的總耐藥率為24.07%，與王印等[11]研究結(jié)果(26.02%)相近。HIV/AIDS合并NTM感染時(shí)的總耐藥率為96.91%，以異煙肼耐藥率最高(96.91%)，其次是卡那霉素(88.66%)和利福平(83.51%)，對(duì)乙胺丁醇(49.48%)耐藥率相對(duì)較低，提示臨床用藥可優(yōu)先考慮此類藥物。

HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是檢測(cè)疾病進(jìn)程的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示HIV/AIDS合并MTB感染者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量多集中在50～200個(gè)/μL，合并NTM時(shí)多低于50個(gè)/μL，提示患者病毒復(fù)制程度高，免疫系統(tǒng)被破壞嚴(yán)重，更易發(fā)生機(jī)會(huì)性感染，臨床用藥時(shí)應(yīng)注意藥物之間的相互作用，更加慎重用藥。