徐婧，邱方，李麗，劉向東

(1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院檢驗科，南京 210009；2. 南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗科，南京 210009；3. 東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，南京 210009)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)舊稱原發(fā)性膽汁性肝硬化，是一類好發(fā)于中老年女性的慢性膽汁淤積性自身免疫性肝病。PBC發(fā)病機制尚未明確，目前認為是遺傳因素和環(huán)境誘因(吸煙、細菌感染、化妝品等)交互作用的結(jié)果[1]。多國的流行病學(xué)調(diào)查顯示，PBC的患病率和年發(fā)病率分別為1.91/10萬～40.2/10萬和0.33/10萬～5.8/10萬[2]。在PBC患者中常見血清堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)進行性升高和特異性自身抗體抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA)陽性[3]。此外，有50%的PBC患者出現(xiàn)抗核抗體(antinuclear antibody, ANA)陽性，其中約1/3的ANA熒光核型為核點型或核膜型，對應(yīng)的靶抗原主要包括斑點蛋白100(speckled protein 100, sp100)、核孔蛋白210(nucleoporin 210, gp210)、核孔蛋白62(nucleoporin p62, p62)、早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein, PML)、類泛素蛋白修飾分子(small ubiquitin-like modifier, SUMO)1/2/3，是AMA陰性且有膽汁淤積表現(xiàn)患者確診為PBC的一個重要依據(jù)[2]。PBC特異性ANA還與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，對疾病預(yù)后判斷有一定的臨床價值[3-4]。本文就PBC特異性ANA的主要亞型抗sp100抗體的特性、臨床意義和相關(guān)作用研究進行綜述。

1 抗sp100抗體的產(chǎn)生和在PBC中作用機制研究

1.1細菌感染在抗sp100抗體產(chǎn)生中的作用 目前認為細菌感染是PBC致病的重要誘因之一。大范圍的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，與其他慢性肝病或自身免疫病患者相比，女性PBC患者存在高比例的反復(fù)尿路感染，致病菌種主要為大腸埃希菌[5]。有研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌PDC-E2與人類PDC-E2的分子結(jié)構(gòu)高度相似，大腸埃希菌可通過分子擬態(tài)和交叉反應(yīng)等機制打破人體對自身PDC-E2抗原的免疫耐受，導(dǎo)致PBC發(fā)生[6]。早期有研究還發(fā)現(xiàn)抗sp100抗體陽性與重復(fù)性尿路感染相關(guān)，而抗gp210抗體的產(chǎn)生與尿道感染不相關(guān)[7]。近年來，Haruta等[8]通過使用不同的鏈霉菌誘導(dǎo)構(gòu)建PBC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)部分PBC模型小鼠不產(chǎn)生AMA，但能檢測出抗gp210抗體和其他多核點型ANA，很可能包含抗sp100抗體。這些結(jié)果均提示抗sp100抗體的產(chǎn)生與PBC患者的細菌感染有關(guān)，但其具體機制尚無相關(guān)研究。

1.2遺傳易感性在抗sp100抗體產(chǎn)生中的作用 一系列針對不同人種的大規(guī)模PBC全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)均證實遺傳易感性在PBC的發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9]。一項來自歐美白人的GWAS數(shù)據(jù)分析表明，不同的HLA類型可能會產(chǎn)生不同的免疫表型，HLA-DPB1基因上的單核苷酸多態(tài)性位點與抗sp100抗體陽性PBC患者相關(guān)[10]。本課題組對中國漢族PBC患者的PBC特異性ANA亞型的GWAS研究結(jié)果表明，主要組織相容性復(fù)合體區(qū)域的rs1794280和rs492899位點與抗sp100抗體相關(guān)聯(lián)，并鑒定出HLA DRβ1-Asn77/Arg74、DRβ1-Ser37、DPβ1-Lys65是決定抗sp100抗體產(chǎn)生的關(guān)鍵位點[11]。這些研究結(jié)果揭示，抗sp100抗體具有強烈的遺傳傾向，為相關(guān)致病機制的研究和治療提供新的線索。

1.3抗sp100抗體識別模式變化在PBC發(fā)病過程中的作用 隨著PBC病情的進展，患者血清中的抗sp100抗體表位識別模式和抗體類型可有變化。Züchner等[12]采用ELISA法對170名PBC患者抗sp100抗體變化進行2年的跟蹤研究，結(jié)果顯示未發(fā)生患者抗sp100抗體陰性轉(zhuǎn)陽性或陽性轉(zhuǎn)陰性的情況；但使用重組全長sp100蛋白(Sp-FL)和重組sp100蛋白片段(Sp-AB、Sp-CD、Sp-DF、Sp-GH和Sp-26)檢測其中9位PBC患者的系列樣本(0個月，12個月，24個月)的抗sp100抗體，發(fā)現(xiàn)2位患者不同時期的血清與靶抗原反應(yīng)性出現(xiàn)變化：其中1位患者在12個月和24個月血清中新增和GH蛋白片段的反應(yīng)性，而在0個月血清中并未出現(xiàn)；另1位患者在0個月和12個月血清和CD蛋白片段呈強反應(yīng)性，而在24個月血清中則明顯減弱；進一步結(jié)合這9名患者的檢測和治療信息分析，推測在PBC疾病自然進程中患者血清中抗sp100抗體能夠出現(xiàn)抗體表位識別模式的改變，且該過程可能由熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)治療過程誘發(fā)或加速。Mytilinaiou等[13]針對52位PBC患者進行長達5年的隨訪，采用線性免疫印跡法檢測這些患者的序列樣本的抗sp100抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨訪初期有17位患者抗sp100抗體陽性，隨訪末期僅有13位患者抗sp100抗體陽性，有1位患者出現(xiàn)抗sp100抗體陰性轉(zhuǎn)陽性，5位患者抗sp100抗體陽性轉(zhuǎn)陰性，其余12位患者抗sp100抗體陽性結(jié)果無改變，提示多數(shù)PBC患者未出現(xiàn)抗體類型的改變。對抗sp100抗體表位識別模式或抗體類型改變的進一步研究將有助于明確抗體的產(chǎn)生原因及其在發(fā)病過程中的作用，揭示PBC的潛在致病機制。

2 抗sp100抗體檢測方法

1987年，Szostecki等[14]采用免疫熒光法對一組自身免疫病患者血清進行分析，發(fā)現(xiàn)在Hep2細胞中呈現(xiàn)典型的核點型熒光模式，并通過Hela細胞核中可溶性蛋白片段的免疫印跡試驗和親和純化sp100特異性自身抗體的免疫熒光試驗證實所有血清的共同抗原靶蛋白為可溶性酸性磷酸化核蛋白sp100。隨后，該團隊對sp100抗原和抗sp100抗體進行一系列研究，利用抗sp100自身抗體血清在λ gt11 cDNA表達文庫篩選并表達含sp100主要抗原位點的sp26蛋白片段，并采用以sp26重組蛋白為靶抗原的ELISA分析在184名PBC患者血清中發(fā)現(xiàn)有50名檢出抗sp100抗體陽性；進一步應(yīng)用肽段分析方法研究PBC疾病相關(guān)的sp100抗原表位，發(fā)現(xiàn)PBC患者的抗sp100抗體多數(shù)能夠至少識別sp-AB(aa1-253)、sp-D(aa282-334)及sp-EH(aa333-474)3個非重疊片段，并提示sp100主要抗原表位位于蛋白C端[15]。Blüthner等[16]則通過噬菌體展示技術(shù)確定sp100的2個主要線性表位及其核心片段分別是SNSKVE(aa303-308)和EPLEVFISA(aa339-347)。上述2個團隊關(guān)于sp100抗原表位研究結(jié)果不盡相同，我們認為肽段分析方法中使用的大片段有可能遮蔽重要的表位，而噬菌體展示技術(shù)需要已有的抗體篩選出具體相關(guān)表位，在檢測患者樣本中的多樣性抗體時可能存在一定的局限性。

目前較為廣泛用于檢測抗sp100抗體的方法主要為間接免疫熒光技術(shù)(indirect immunofluorescence，IIF)[17]、ELISA[18-19]、免疫印跡法[20]等。一項研究用ELISA技術(shù)和IIF 2種方法對PBC患者的抗sp100抗體進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELISA方法和IIF方法對抗sp100抗體的檢測特異性分別為99%及98%，敏感性分別為44%和34%[17]。IIF方法在檢測ANA核型過程中對核型分類具有一定的價值，但不能給出準(zhǔn)確的定量結(jié)果，并且涉及人為的主觀判斷。而ELISA方法靈敏度高，更具性價比，適合用于臨床樣本的大批量檢測。目前，國內(nèi)醫(yī)院常將抗sp100抗體作為自身免疫性肝病抗體譜的篩查項目之一，采用免疫印跡法檢測，已有的研究結(jié)果顯示其具有高特異性[20]。張海萍等[21]采用3種不同的免疫方法，包括化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence analysis，CLIA)、免疫印跡法和ELISA法，針對抗sp100抗體開展檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同方法的檢測結(jié)果具有基本相當(dāng)?shù)臋z測性能和良好的一致性。CLIA有著精確定量、檢測線性范圍寬等優(yōu)勢，有望在未來的抗sp100抗體檢測中得到普及。

3 PBC中抗sp100抗體的臨床價值

3.1抗sp100抗體在PBC診斷和預(yù)后中的意義 抗sp100抗體在PBC診斷中存在高特異性和較低的敏感性，但值得關(guān)注的是AMA陰性患者的抗sp100抗體陽性檢出率要高于AMA陽性患者[11,17]。鑒于抗sp100抗體對PBC尤其是AMA陰性PBC有重要的診斷價值，美國肝病研究學(xué)會和歐洲肝病研究協(xié)會在新版的原發(fā)性膽汁性膽管炎實踐指南中均提出，在AMA陰性情況下，其他PBC特異性抗體(包括抗sp100抗體或抗gp210抗體)陽性可作為PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[3,22]。

目前，關(guān)于抗sp100抗體作為PBC預(yù)后預(yù)測指標(biāo)的價值尚未有統(tǒng)一結(jié)論。早期歐美白人用ELISA法對PBC患者進行抗體檢測，臨床相關(guān)性分析結(jié)果顯示抗sp100抗體陽性和陰性患者的年齡、性別、組織學(xué)分期、生化和免疫球蛋白指標(biāo)方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且對UDCA治療效果影響不大。但隨訪研究發(fā)現(xiàn)核點型抗體陽性患者比陰性患者更容易進展到組織學(xué)晚期，提示抗sp100抗體與不良預(yù)后可能有一定關(guān)聯(lián)[12]。Mytilinaiou等[13]采用免疫印跡法對52名PBC患者(共采集352個系列樣本)進行2～10年期的抗sp100抗體的動態(tài)變化跟蹤研究，結(jié)果顯示抗sp100抗體水平和用于PBC疾病預(yù)后預(yù)測的梅奧風(fēng)險評分顯著正相關(guān)，抗sp100抗體陽性較陰性患者的病情更為嚴(yán)重，發(fā)病時間更年輕、病程更長。Hu等[19]用ELISA法對198名PBC患者進行抗體譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗sp100抗體陽性與肝臟相關(guān)生化指標(biāo)變化無關(guān)。近年，Yang等[20]采用免疫印跡法對276名漢族PBC患者進行抗體檢測，結(jié)合患者的臨床數(shù)據(jù)，應(yīng)用多個PBC預(yù)后模型進行風(fēng)險預(yù)測研究，結(jié)果顯示抗sp100抗體陽性和陰性的PBC患者的5年不良后果生存率差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2抗sp100抗體在PBC病情監(jiān)測和治療中的價值 抗sp100抗體效價水平與PBC疾病進展及嚴(yán)重程度的關(guān)系還存在著一定的爭議。Gatselis等[18]對14名抗sp100抗體陽性PBC患者進行3年期的隨訪，系列血清樣本的ELISA法檢測結(jié)果顯示抗sp100抗體的效價降低與梅奧風(fēng)險評分的改善和UDCA應(yīng)答相關(guān)。而Tana等[23]對27名PBC患者進行長達約20年的隨訪，系列血清樣本的ELISA法檢測結(jié)果表明，有6名抗sp100抗體陽性患者的抗體效價水平隨著時間產(chǎn)生顯著變化，且抗體效價水平的降低與肝活檢組織的纖維化程度增高相關(guān)。盡管以上結(jié)果看似矛盾，但均提示抗sp100抗體效價變化可預(yù)示PBC的病情變化，將有助于對PBC的病程監(jiān)測。

近期Beattie團隊采用免疫印跡法檢測抗sp100抗體，研究其對UDCA應(yīng)答反應(yīng)影響，結(jié)果顯示，抗sp100抗體陽性與陰性PBC患者間UDCA治療的應(yīng)答率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[24]，該結(jié)果提示抗sp100抗體在PBC患者的UDCA治療中指導(dǎo)作用有限。

4 總結(jié)和展望

特定的遺傳易感位點和反復(fù)尿路感染因素可能對抗sp100抗體的產(chǎn)生起著重要作用，然而發(fā)生作用及參與PBC發(fā)病的機制仍有待進一步的研究。病程中抗sp100抗體類型或表位識別模式有改變，提示抗sp100抗體存在較為獨特的產(chǎn)生機制和致病原因?？箂p100抗體對AMA陰性PBC確診有重要的價值，不僅可減少不必要的肝組織活檢，還可幫助患者早診斷、早治療，進而有效延緩疾病進程，降低晚期肝纖維化甚至肝硬化風(fēng)險。

目前，臨床上常用的抗sp100抗體的檢測方法多為定性分析，如免疫印跡法、ELISA、IIF等，尚無法實現(xiàn)抗體水平變化的動態(tài)監(jiān)測。其主要原因為目前沒有相應(yīng)的參考物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)品，這導(dǎo)致抗sp100抗體的不同檢測方法和不同品牌試劑的檢測結(jié)果欠缺可比性，也是不同PBC患者的研究分析中存在不同研究結(jié)論的可能原因。隨著化學(xué)發(fā)光和熒光定量檢測方法的發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)品的研發(fā)，監(jiān)測其水平在疾病發(fā)生發(fā)展和藥物治療中的動態(tài)變化，將有助于明確抗sp100抗體水平變化對病情活動度和藥物療效的臨床價值。