余漢忠,牛璐璐,孔倩倩,李小川,蔡佩君,王麗

(1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院 徐州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科, 江蘇徐州 221009；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院, 江蘇徐州 221009)

2019新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)核酸檢測(cè)在疫情防控中至關(guān)重要。各廠家快速研發(fā)的各種核酸提取和檢測(cè)試劑盒并不穩(wěn)定[1]，在檢測(cè)前需要進(jìn)行充分的性能驗(yàn)證及試劑比對(duì)，并積極開展實(shí)驗(yàn)室間的室間質(zhì)評(píng)比對(duì)活動(dòng)，才能確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠。本研究對(duì)徐州市第一人民醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室采用的2種核酸提取方法和2種2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)樣本的結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1樣本 2020年江蘇省臨床檢驗(yàn)中心5月17日發(fā)放的2019-nCoV核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本5份(樣本號(hào)：209601、209602、209603、209604、209605)和2020年國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心6月17日發(fā)放的2019-nCoV核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本10份(樣本號(hào)：202001、202002、202003、202004、202005、202006、202007、202008、202009、202010)。

1.2儀器與試劑 SLAN-96P全自動(dòng)熒光PCR儀(上海宏石公司)，AW-1000全自動(dòng)核酸提取儀(江蘇碩世公司)；新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20200302)、磁珠法核酸提取試劑盒(批號(hào)：SDK60105)源自江蘇碩世公司(A公司)，新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：2020076)、核酸釋放劑(批號(hào)：2020043)源自湖南圣湘公司(B公司)。

1.3方法 接收室間質(zhì)評(píng)樣本當(dāng)天即進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第五版)》[2]要求進(jìn)行生物安全防護(hù)。根據(jù)核酸提取和擴(kuò)增試劑的不同，分為3種組合。組合1：A公司磁珠法核酸提取試劑+核酸檢測(cè)試劑，組合2：B公司核酸釋放劑+核酸檢測(cè)試劑，組合3：A公司磁珠法核酸提取試劑+B公司核酸檢測(cè)試劑。

1.3.1核酸提取 (1)磁珠法：用A公司核酸提取試劑盒及AW-1000全自動(dòng)核酸提取儀，質(zhì)評(píng)樣本充分混勻后，吸取200 μL加入相應(yīng)深孔板第一列，放入提取儀，選擇相應(yīng)程序自動(dòng)提取；(2)核酸釋放劑法：八聯(lián)管中加入10 μL B公司樣本核酸釋放劑，質(zhì)評(píng)樣本充分混勻后，吸取10 μL加入八聯(lián)管，充分混勻，靜置10 min。均按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.2核酸擴(kuò)增 用SLAN-96P全自動(dòng)熒光PCR儀及核酸檢測(cè)試劑，根據(jù)試劑說明書配制反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)及檢測(cè)結(jié)果判定。

A公司核酸檢測(cè)試劑PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括RT-PCR反應(yīng)液7.5 μL，酶混合液5 μL，新冠三重反應(yīng)液4 μL，去RNA酶H2O 3.5 μL，核酸模板樣本量5 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min；預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 40 s，退火、延伸、測(cè)熒光55 ℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)。結(jié)果判讀：FAM(ORF1ab)、ROX(N)、HEX(內(nèi)標(biāo))3個(gè)通道Ct≤35且擴(kuò)增曲線為S形曲線者，判定為該基因檢測(cè)結(jié)果為陽性；Ct>38判定為該基因檢測(cè)結(jié)果為陰性；35

B公司核酸檢測(cè)試劑的PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括RT-PCR反應(yīng)液26 μL，酶混合液4 μL，核酸模板樣本量20 μL；PCR擴(kuò)增參數(shù)為：逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min；預(yù)變性95 ℃ 1 min；變性95 ℃ 15 s，退火、延伸、測(cè)熒光60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；冷卻25 ℃ 10 s。結(jié)果判讀：FAM(ORF1ab)、ROX(N)、HEX(內(nèi)標(biāo))3個(gè)通道Ct≤40且擴(kuò)增曲線為S形曲線者判定為該基因檢測(cè)結(jié)果為陽性，Ct>40判定為該基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，擴(kuò)增曲線異常時(shí)需復(fù)查。

1.3.3質(zhì)量控制 試劑盒自帶陰性和陽性對(duì)照，若陰性和陽性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果在控，則該批次試驗(yàn)結(jié)果有效；若陰性和陽性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果不在控，則該批次試驗(yàn)結(jié)果無效。設(shè)置環(huán)境評(píng)估樣本1個(gè)，為陰性對(duì)照開口放置于PCR實(shí)驗(yàn)室Ⅱ區(qū)過夜，用質(zhì)評(píng)樣本檢測(cè)方法檢測(cè)，評(píng)估有無環(huán)境污染。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作后結(jié)果良好，陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、環(huán)境評(píng)估樣本均在控制范圍內(nèi)。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨檢中心和江蘇省臨床檢驗(yàn)中心的室間質(zhì)評(píng)結(jié)果回報(bào)，除209602、209604、202001、202006、202008號(hào)樣本為雙位點(diǎn)未檢出外，其余室間質(zhì)評(píng)樣本均為雙位點(diǎn)陽性。3種試劑組合對(duì)陰性質(zhì)評(píng)樣本均為未檢出，陰性結(jié)果符合率均為100%，對(duì)陽性質(zhì)評(píng)樣本各基因的檢出結(jié)果見表1。

3 討論

準(zhǔn)確的2019-nCoV病原鑒定對(duì)新型冠狀病毒肺炎疑似患者治療方案的確定、感染的控制都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3-4]。本研究選取了徐州市第一人民醫(yī)院現(xiàn)在使用的2種2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑及2種提取方法對(duì)室間質(zhì)評(píng)樣本進(jìn)行分析。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，磁珠法提取的核酸用A和B公司核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)的有效檢出率都能達(dá)到100%。但B公司核酸釋放劑法提取后的核酸使用B公司核酸檢測(cè)試劑對(duì)陽性質(zhì)評(píng)樣本ORF1ab基因的檢出率為70%，N基因檢出率為90%，說明核酸提取效果不佳。而磁珠法提取的核酸再用B公司核酸檢測(cè)試劑檢測(cè)質(zhì)評(píng)樣本的結(jié)果表明，所有陽性樣本的Ct值均小于其他2種組合，說明此試劑組合對(duì)室間質(zhì)評(píng)陽性樣本均能更靈敏地檢出靶基因[5]。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)2種某一批號(hào)的試劑用國(guó)家衛(wèi)健委臨檢中心和江蘇省臨床檢驗(yàn)中心的室間質(zhì)評(píng)樣本作了簡(jiǎn)單的比較分析，因?yàn)闃颖玖枯^少，可能并不代表2種試劑的整體檢測(cè)能力。目前國(guó)內(nèi)疫情放緩，研究對(duì)象缺乏，若能獲取大數(shù)量的陽性樣本，可以對(duì)不同提取和擴(kuò)增試劑進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)。