陸恒章，于美玲，程美慧，劉洋，劉長城，趙微

（錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物教研室，遼寧 錦州 121000）

輪狀病毒是一種雙鏈RNA病毒，屬于呼腸弧病毒屬（Reoviridae），是嬰幼兒腹瀉的主要病因［1］。腸道病毒感染能夠?qū)е滤拗鞯哪c道黏膜屏障功能破壞，改變腸道通透性，從而造成腹瀉癥狀；腸道病毒感染也可改變腸道微生物的組成和活性，如脊髓灰質(zhì)炎病毒［2］、呼腸孤病毒［3］、諾如病毒［4］和鼠輪狀病毒［5］，可影響腸道微生物群落，導(dǎo)致宿主腹瀉。腸道菌群的改變主要表現(xiàn)為厭氧菌的減少、需氧菌的相對增多及腸道微生物多樣性顯著降低［6-7］。

本研究擬通過16S rDNA測序法檢測乳鼠感染輪狀病毒后腸道菌群的組成、微生物差異性及菌群特征，通過實時熒光定量PCR檢測乳鼠腹瀉模型腸道黏膜屏障功能相關(guān)基因的表達及腸道通透性的改變，從而探討輪狀病毒感染后腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與腸道黏膜屏障功能的關(guān)系。為進一步了解腸道菌群與輪狀病毒感染之間的相互作用，預(yù)防和治療輪狀病毒感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級昆明系小鼠由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（ScXK［遼］2019-0003）。飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室內(nèi)，自由飲食水，環(huán)境溫度22.2 ℃，濕度40%～70%，12 h光暗循環(huán)（SYxK［遼］2019-0007）。所有操作均符合錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的實驗動物倫理要求（審批號：2019014）。

輪狀病毒SA11株由錦州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室提供。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）購 自大連TaKaRa公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-dextran）購自美 國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 輪狀病毒感染乳鼠腹瀉模型的建立：采用清潔級昆明系小鼠10窩，同窩繁育，每窩飼養(yǎng)雌性6只和雄性1只，合籠21 d后隨機獲得乳鼠20窩（乳鼠雌雄不拒），將20窩乳鼠隨機分為為輪狀病毒感染（RV）組與對照（NC）組，10窩/組。每窩8～12只乳鼠與1只哺乳期母鼠飼養(yǎng)于單獨通風(fēng)的IVC籠中。乳鼠5日齡時體質(zhì)量約為8～9 g。乳鼠出生后第1天記為1日齡。待乳鼠4～5日齡后開始實驗。實驗組每天每只乳鼠灌胃1×107病毒感染熒光灶個數(shù)（fluorescent focus unit，F(xiàn)FU）/mL的SA11株輪狀病毒100 μL；對照組每天每只乳鼠灌胃PBS 100 μL，連續(xù)灌胃4 d，每天觀察乳鼠排便情況。

1.2.2 實驗動物的處理及樣品的收集與保存：所有乳鼠連續(xù)灌胃4 d后（即實驗組出現(xiàn)最嚴重腹瀉癥狀時間點）實施頸椎脫臼法處死，在超凈工作臺中，用高壓滅菌的手術(shù)器械收集結(jié)腸和直腸的混合腸道內(nèi)容物以及結(jié)腸和直腸組織，置于無菌EP管中，立即置于-80 ℃凍存。

1.2.3 乳鼠糞便DNA提取和PCR擴增：根據(jù)QIAamp糞便DNA迷你提取試劑盒（美國Qiagen公司）說明書操作，從混合腸道內(nèi)容物中提取基因組DNA。利用引物341F（5’ -CCTACGGGRSGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’）擴增細菌16s核糖體RNA基因（342F和806R）V3～V4區(qū)。PCR程序為：95 ℃3 min，98 ℃20 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，30個循環(huán)，72 ℃延長5 min。PCR反應(yīng)體系為：2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 50 ng，加ddH2O至總體積30 μL。2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（美國AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和2%瓊脂糖凝膠電泳進行文庫質(zhì)檢。

1.2.4 16S rDNA測序及關(guān)聯(lián)分析：16S rDNA PCR擴增區(qū)域為V3～V4區(qū)，采用通用引物341F和806R進行PCR擴增。PCR擴增后進行文庫質(zhì)檢、Qubit進行文庫定量。使用Illumina Miseq PE250進行測序分析。獲得的測序數(shù)據(jù)進行物種分類和豐度分析，以及α多樣性分析、β多樣性分析。使用LEfSe在屬水平上選擇差異物種，行Spearman相關(guān)性分析，繪制差異物種與檢測因子的相關(guān)性熱圖。

1.2.5 乳鼠結(jié)直腸糞便RNA提取及cDNA合成：稱取各組結(jié)腸和直腸組織0.1 g于1.5 mL離心管中，加入0.9 mL PBS緩沖液，加入5～10顆瓷珠后，置于珠式樣品研磨器中研磨2 min。取250 mL組織研磨液于新的1.5 mL離心管中用于RNA提取。采用TRIzol法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA提取液10 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 μL，Gene Specific Primer 5 pmol，5×PrimeScript Buffer 4 μL，加ddH2O至總體積為20 μL，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.2.6 實時熒光定量PCR測定病毒基因拷貝數(shù)及緊密連接蛋白基因的表達：

1.2.6.1 病毒基因拷貝數(shù)檢測 擴增SA11衣殼蛋白VP6特異性基因并繪制標準曲線VP6基因引物序列如表1所示。擴增產(chǎn)物164 bp。擴增產(chǎn)物純化回收，構(gòu)建標準質(zhì)粒，檢測標準質(zhì)粒濃度為290.5 ng/μL。10倍梯度稀釋標準品質(zhì)粒，每個樣品重復(fù)3次，以Ct值為橫坐標，lg基因拷貝數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線。計算標準質(zhì)粒DNA基因拷貝數(shù)（copies/mL）=6.02×1023/mol×質(zhì)粒濃度（g/mL）/分子量（MWg/mol）。

表1 PCR引物Tab.1 Primer sequences

1.2.6.2 緊密連接蛋白基因表達檢測 根據(jù)小鼠腸道細胞緊密連接蛋白1（tight junction protein 1，TJP-1）、緊密連接蛋白4（claudin-4）、連接黏附分子（F11 receptor，F(xiàn)11R）基因設(shè)計特異性引物，以小鼠Gapdh為內(nèi)參基因，引物序列見表1。實時熒光定量PCR的具體步驟按照TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）說明書操作，設(shè)3組重復(fù)。根據(jù)溶解曲線的結(jié)果判斷設(shè)計的引物是否可行，采用2-ΔΔCt計算相對定量。

1.2.7 乳鼠腸道通透性檢測：連續(xù)灌胃4 d后，NC組和RV組各取2～3只乳鼠于單獨籠中斷食8～10 h后，分別給乳鼠灌胃FITC-dextran 0.6 mg/g，6 h后麻醉，將乳鼠置于動物活體成像儀中，在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長535 nm下觀察乳鼠腸道通透性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 輪狀病毒感染乳鼠腹瀉模型檢測

連續(xù)灌胃4 d后，可觀察到RV組乳鼠水樣腹瀉，糞便呈黃色；而NC組乳鼠無腹瀉。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果如表2、圖1所示，RV組輪狀病毒SA11毒株VP6基因的拷貝數(shù)于感染第4天達頂峰（1.32×109copies/mL）。

圖1 輪狀病毒感染后1～7 d乳鼠糞便樣本中輪狀病毒拷貝數(shù)Fig.1 Copy number of rotavirus in stool samples 1 to 7 days after rotavirus infection

表2 病毒拷貝數(shù)Tab.2 Number of virus copies

2.2 乳鼠腸道內(nèi)容物16S rDNA測序分析

2.2.1 α多樣性指數(shù)分析和β多樣性分析：在Illumina MiSeq PE250平臺上運行并按方法進行質(zhì)量過濾后，所有樣本共生成1 182 607條reads，根據(jù)Alpha多樣性分析，兼顧測序飽和度和樣品完整性，對每個樣品隨機抽取47 504條reads。根據(jù)各樣本的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）計數(shù)，對樣本序列多樣性和豐富度進行評價，NC組與RV組實際觀測到的OTU數(shù)量用observed_species指數(shù)比較，2組的OTU數(shù)量存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.034），見圖2A。為了比較2組細菌群落組成的差異，利用Adonis分析微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。采用Unweighted_UniFrac未加權(quán)比較2組腸道內(nèi)容物細菌組成，結(jié)果如圖2B所示，2組有明顯的分離（Adonis檢驗P=0.001，R2=0.192）。RV組與NC組的細菌組成有顯著差異。

圖2 組間α多樣性分析和β多樣性分析Fig.2 α diversity analysis and β diversity analysis between groups

2.2.2 物種分類與相對豐度分析和顯著性差異分析：根據(jù)物種注釋結(jié)果，在屬水平對樣品內(nèi)的豐度進行分析，結(jié)果如圖3A所示，與NC組相比，RV組乳酸桿菌（Lactobacillus）豐度（36.29%）、幽門螺桿菌（Helicobacter）豐度（0%）、梭桿菌（Fusobacterium）豐度（4.74%）均減少，志賀氏菌（Shigella）豐度（43.48%）增加。在屬水平上對所有物種進行分析，如表3所示，未發(fā)現(xiàn)未通過P值篩選的物種，經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗，RV組與NC組間有10個屬存在明顯差異。2組之間屬水平的顯著差異如圖3所示，NC組的優(yōu)勢屬為Lactobacillus、Paenibacillus、Brevundimonas、Parabacteroides、Bacteroides和Alloprevotella，而RV組的富集屬為Enterococcus和Shigella。

圖3 樣品組成多樣性分析及顯著性差異分析Fig.3 Analysis of sample composition diversity and significant difference

表3 乳鼠RV感染后的差異性菌屬Tab.3 Differential bacteria genera after RV infection in suckling mice

2.3 RV感染后乳鼠TJP-1、claudin-4和F11R基因表達情況

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，RV組claudin-4基因相對表達量（5.41±0.47）增加了448%（P＜ 0.001）、F11R基因（4.46±1.44）增加了541%（P＜ 0.001），而TJP-1基因（0.46±0.08）降低了56%（P＜ 0.001），表明輪狀病毒感染后乳鼠腸道黏膜屏障功能發(fā)生了改變。

2.4 Spearman相關(guān)性分析

Spearman與檢測因子的相關(guān)性分析結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)11R基因的表達與短單胞菌屬和擬桿菌屬呈負相關(guān)；claudin-4基因的表達與短單胞菌屬呈負相關(guān)；TJP-1基因的表達與短單胞菌屬呈正相關(guān)。

圖4 差異物種與檢測因子的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between different species and detection factors

2.5 乳鼠腸道通透性變化

如圖5所示，RV組腸通透性明顯增加，F(xiàn)ITC-dextran通過腸上皮細胞進入血液，導(dǎo)致乳鼠腸道外的部位出現(xiàn)熒光，NC組FITC-dextran則無法通過腸上皮而聚集在腸道中。

圖5 動物活體成像儀下觀察腸道通透性熒光圖Fig.5 Fluorescence image of intestinal permeability observed by in vivo animal imager

3 討論

輪狀病毒是引起兒童腹瀉最常見的病原體，腸道病毒進入人體后會先與微生物群接觸，故微生物群的組成可能影響輪狀病毒感染［8］。研究［9-10］顯示，感染了輪狀病毒的嬰兒腸道微生物多樣性低于健康兒童。關(guān)于腸道微生物組成與輪狀病毒之間的相互作用關(guān)系的研究仍然比較少。本研究結(jié)果顯示，輪狀病毒感染組乳鼠腸道菌群多樣性低于NC組，因此，推測腸道微生物群在腹瀉相關(guān)過程中發(fā)揮了重要作用。

緊密連接主要位于上皮細胞頂端表面，是上皮細胞間連接最為重要的結(jié)構(gòu)復(fù)合物，在維持腸黏膜的屏障功能方面發(fā)揮重要作用［11］。目前有多種蛋白已經(jīng)被證實參與了緊密連接的形成，包括claudin、TJP、OCLN、F11R和ZO家族。緊密連接蛋白常被用作觀察腸道緊密連接屏障功能和通透性的指標［12］。本研究中，輪狀病毒感染后，乳鼠TJP-1基因的表達顯著下降。TJP-1作為調(diào)控細胞緊密連接的關(guān)鍵因子，具有連接細胞間屏障和調(diào)節(jié)肌動蛋白的作用，可增強細胞間連接［13］。TJP-1低表達可破壞細胞的緊密連接，導(dǎo)致病原體和其他物質(zhì)進入腸腔引起腹瀉［14］。本研究還發(fā)現(xiàn)，短單胞菌屬的多樣性與TJP-1的表達具有顯著的相關(guān)性。研究［15-16］表明，短單胞菌屬會在宿主免疫功能降低時作為機會病原體感染宿主，提示可能是輪狀病毒感染影響了乳鼠TJP-1的表達，導(dǎo)致短單胞菌屬多樣性增加。

claudin-4是緊密連接蛋白家族成員之一，參與保持正常組織細胞之間的緊密連接。claudin-4蛋白在細胞膜表面異常表達，可能引起細胞極性破壞，細胞間的連接變松散，細胞間黏附力下降［17］，進而破壞腸道屏障功能。而F11R基因編碼F11受體蛋白，也稱連接黏附因子（iunctional adhesion molecule，JAM-A），是免疫球蛋白超家族成員，是參與細胞緊密連接的跨膜蛋白，通過調(diào)節(jié)上皮通透性、炎癥和增殖來維持腸道內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡［18］。有研究［19］表明，呼腸孤病毒能通過F11R進入感染內(nèi)皮細胞，從而增強呼腸孤病毒的傳播。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)輪狀病毒感染后乳鼠claudin-4和F11R基因表達水平顯著升高，表明claudin-4和F11R表達的增加可能會影響腸道黏膜屏障的功能，但目前這2個基因?qū)δc道黏膜屏障功能的具體作用還存在爭論，需要進一步的研究探索。本研究通過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，短單胞菌屬及擬桿菌屬的多樣性與claudin-4和F11R表達的增加呈負相關(guān)，表明這2種基因表達可能還影響了短單胞菌屬和擬桿菌屬的多樣性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了輪狀病毒感染前后乳鼠腸道內(nèi)10種顯著差異菌屬，檢測了改變腸道黏膜屏障功能相關(guān)基因TJP-1、claudin-4和F11R的表達變化情況。并發(fā)現(xiàn)短單胞菌屬和擬桿菌屬與TJP-1、claudin-4和F11R的表達存在一定的相關(guān)性。通過對病毒感染后腸道微生物群落的深入挖掘，對輪狀病毒微生態(tài)制劑的研發(fā)及臨床應(yīng)用、輔助臨床腹瀉的預(yù)防和治療具有一定意義。同時深度剖析影響病毒復(fù)制的腸道共生菌，為篩選診治病毒感染的靶點提供了新的思路。