董超，張麗君

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，沈陽 110001）

含WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋白連接酶2（WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2）是NEDD4樣蛋白家族中的一種E3泛素連接酶［1-2］。它可將泛素連接至靶蛋白，并促使蛋白酶體降解靶蛋白［3-4］。E3泛素化連接酶參與了氧化應(yīng)激相關(guān)過程，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［3-5］。研究［6-9］表明，泛素化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，與血液系統(tǒng)疾病，如淋巴瘤、骨髓瘤、再生障礙性貧血、急性白血病也有一定聯(lián)系。p21，也稱CDKN1A/CIP1/WAF1/SDI1，是首個(gè)被鑒定出的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）復(fù)合物抑制劑［10］，最近的研究發(fā)現(xiàn)，p21在抑制腫瘤中發(fā)揮重要作用，可能成為新治療策略的重點(diǎn)。目前已報(bào)道的WWP2底物有Gsc、PTEN、TGFβ、Smads、EGR2以 及Oct4等［11-15］。然 而，WWP2與p21之間的作用尚不清楚。因此，本研究擬探討E3泛素連接酶WWP2與p21的相互作用，及WWP2通過蛋白酶體途徑降解p21的機(jī)制，為腫瘤的治療及研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK 293T細(xì)胞系（人腎上皮細(xì)胞系衍生株）來自中國醫(yī)科大學(xué)健康科學(xué)研究所心血管內(nèi)科研究室。MG132、放線菌酮（cycloheximide，CHX）購自美國ApexBio公司；WWP2質(zhì)粒購自中國銳博生物公司；anti-HA、anti-GAPDH、anti-p21、二抗試劑購自美國Proteintech公司；anti-WWP2購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)HEK 293T細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)、生長密度換液、傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用PBS緩沖液洗滌待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（生長密度約70%），并更換新鮮培養(yǎng)基，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑行過表達(dá)WWP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。室溫下孵育15～20 min，緩慢將轉(zhuǎn)染體系吹勻后滴入培養(yǎng)基中并晃勻，置入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后48 h，收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用PBS緩沖液洗滌待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（生長密度約70%），并更換新鮮培養(yǎng)基，用jetPrime轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行WWP2siRNA轉(zhuǎn)染。室溫下孵育15～20 min，緩慢將轉(zhuǎn)染體系吹勻后滴入培養(yǎng)基中并晃勻，置入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)12～24 h，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后72 h，收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blotting：用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX（50 μmol/L）或蛋白酶體抑制劑MG132（50 μmol/L）處理過表達(dá)或敲減WWP2的293T細(xì)胞0、4、8 h后，收集細(xì)胞并裂解，4 ℃、13 300 r/s離心20 min，收集蛋白。BCA法行蛋白定量后上樣，行SDS電泳，4 ℃、恒流200 mA、120 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%BSA室溫封閉1 h。加入一抗（用含有1%BSA的TBST試劑1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液漂洗膜3次。過氧化物酶法顯色，用Image J軟件測量條帶灰度值。GAPDH作內(nèi)參照。

1.2.4 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）實(shí)驗(yàn)：蛋白制備及定量步驟同Western blotting。在Co-IP蛋白樣品中加入1～3 μL相應(yīng)抗體后，于4 ℃混轉(zhuǎn)3 h后，加入30 μL beads并混勻，4 ℃混轉(zhuǎn)過夜。棄上清，加入1 mL細(xì)胞裂解液，4 ℃混轉(zhuǎn)10～15 min，重復(fù)3次。加 入25～30 μL 2×Loading Buffer，與input同在沸水中加熱7 min，瞬離后備用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同Western blotting。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有圖片用Photoshop2019、Adobe Illustrator 2019軟件處理后，以GraphPad Prism8作圖，并采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用One-way ANOVA分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWP2與p21相互作用

通過Co-IP及Western blotting檢 測293T細(xì)胞中WWP2與p21的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，WWP2與p21之間存在結(jié)合（圖1）。

圖1 WWP2與p21相互作用Fig.1 Interaction between WWP2 and p21

2.2 WWP2可調(diào)節(jié)p21的表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示，在293T細(xì)胞中過表達(dá)WWP2，p21的表達(dá)水平明顯降低（圖2A）。且隨著WWP2表達(dá)量的增加，p21的表達(dá)水平相應(yīng)降低（圖2C）。而敲減WWP2后，p21的表達(dá)水平相應(yīng)增加（圖2B）。以上結(jié)果說明WWP2可影響p21的表達(dá)水平，調(diào)控p21的穩(wěn)定性，提示W(wǎng)WP2可能通過蛋白酶體途徑降解p21。

圖2 WWP2對p21的表達(dá)存在負(fù)向影響Fig.2 The expression level of WWP2 gene had a negative effect on the expression of p21

2.3 CHX處理WWP2過表達(dá)及敲減細(xì)胞系

用CHX處理過表達(dá)WWP2的293T細(xì)胞0、4、8 h。如圖3A所示，隨著CHX作用時(shí)間延長，對照組和過表達(dá)組p21的表達(dá)水平均逐漸下降。過表達(dá)WWP2使p21的半衰期縮短，表明過表達(dá)WWP2可降低p21蛋白的穩(wěn)定性。用CHX處理敲減WWP2的293T細(xì)胞 0、4、8 h。如圖3C所示，隨著CHX作用時(shí)間的延長，對照組和敲減組p21的表達(dá)水平均逐漸升高。敲減WWP2使p21的半衰期延長，表明敲減WWP2能增加p21蛋白的穩(wěn)定性。以上結(jié)果提示，WWP2能降低p21的表達(dá)水平。

圖3 CHX處理WWP2過表達(dá)及敲減293T細(xì)胞系Fig.3 CHX-treated WWP2 overexpressed or knockdown 293T cell lines

2.4 MG132處理WWP2過表達(dá)及敲減細(xì)胞系

MG132作用WWP2過表達(dá)293T細(xì)胞0、4、8 h，用Western blotting檢測WWP2、p21和內(nèi)參GAPDH的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4A所示，隨著MG132作用時(shí)間的延長，對照組和過表達(dá)組p21的表達(dá)水平均逐漸上升。相對于過表達(dá)組，HA-空載組p21蛋白表達(dá)在MG132處理后變化更顯著。說明WWP2能降低p21的表達(dá)水平，MG132可阻斷WWP2對p21的負(fù)性調(diào)控，使內(nèi)源性p21的累積增加。

MG132作用WWP2敲減293T細(xì)胞0、4、8 h，用Western blotting檢測WWP2、p21和內(nèi)參GAPDH的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4C所示，隨著MG132作用時(shí)間的延長，對照組和敲減組p21的表達(dá)水平均逐漸上升。相對于未敲減組，敲減組p21蛋白表達(dá)在MG132處理后變化更顯著。說明WWP2使p21的表達(dá)水平下降。

圖4 MG132處理WWP2過表達(dá)及敲減細(xì)胞系Fig.4 MG132-treated WWP2 overexpressed and knockdown cell lines

以上均提示體系中p21的降解依賴于蛋白酶體途徑，證實(shí)了WWP2通過蛋白酶體途徑介導(dǎo)p21的降解。

3 討論

WWP2可將泛素連接至靶蛋白，并促使蛋白酶體降解靶蛋白［3］。研究表明，泛素化不僅與腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)［4］，還與抗癌藥物的耐藥性相關(guān)［16］。近年來，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21在抑瘤功能中的重要性突顯，并因此成為研究治療策略的重點(diǎn)。

WWP2是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）的成員之一，該系統(tǒng)是蛋白質(zhì)降解的主要通路之一，多種蛋白的調(diào)節(jié)功能與這一系統(tǒng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WWP2與p21之間存在結(jié)合。過表達(dá)WWP2使293T細(xì)胞p21蛋白表達(dá)水平降低，敲減WWP2則使293T細(xì)胞p21蛋白表達(dá)水平增加，提示W(wǎng)WP2可調(diào)節(jié)p21的表達(dá)水平。

為了進(jìn)一步確定蛋白酶體途徑是否與p21蛋白降解過程有關(guān)，本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理293T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組與實(shí)驗(yàn)組p21表達(dá)水平均隨CHX作用時(shí)間延長而減少；且過表達(dá)WWP2后p21的半衰期縮短，敲減WWP2則使p21的半衰期延長。以上均證實(shí)WWP2并非在翻譯合成的方向調(diào)控p21。

為了進(jìn)一步檢測293T細(xì)胞中p21的降解情況，本研究應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132處理293T細(xì)胞。MG132是蛋白酶體特異性抑制劑，主要通過抑制蛋白酶體系統(tǒng)而使相應(yīng)蛋白在體內(nèi)積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組和實(shí)驗(yàn)組p21表達(dá)水平均隨MG132作用時(shí)間延長呈梯度增加。說明體系中p21的降解依賴于蛋白酶體途徑。相對于過表達(dá)組，HA-空載組在MG132處理后p21變化水平更為明顯。相對于未敲減組，敲減組在MG132處理后p21變化水平更為明顯。表明WWP2可通過蛋白酶體途徑降解p21。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶WWP2可通過蛋白酶體途徑調(diào)控p21的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果有望推動(dòng)WWP2及泛素化的研究，為疾病的診療提供理論依據(jù)。