黃理安,黃孝靜,羅保平
代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是以中心性肥胖、脂代謝異常、高尿酸、高血壓為主要特征,胰島素抵抗為共同的病理生理基礎(chǔ),多種物質(zhì)代謝異常的一組復(fù)雜證候群,是1型糖尿病和心腦血管疾病的代謝性危險因素,但病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確[1]。MS主要臨床表現(xiàn)為肥胖、高血壓、胰島素抵抗等靶器官損傷[2],這些心血管危險因素聚集表現(xiàn)為對腎臟損害有協(xié)同作用[3],腎臟損傷的臨床表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率高,尿清蛋白排泄率增加,腎小管功能改變[4-5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腎藏精,精血互生,以養(yǎng)肝木,疏肝理氣;腎精不足,陰虛陽亢,以致肝失疏泄,氣化失司,中焦氣機(jī)壅滯,運(yùn)化失常,加重體內(nèi)痰濕,導(dǎo)致肥胖及血脂紊亂更甚[6]。因此,MS不僅導(dǎo)致心血管事件發(fā)生危險增加,同時損害腎臟,腎臟損害又反之加重MS的心血管并發(fā)癥,因此,腎臟損害的早期發(fā)現(xiàn)和治療應(yīng)受到高度重視[7]。
臨床治療MS的原則以逆轉(zhuǎn)糖代謝異常、脂代謝紊亂、高血壓、胰島素抵抗、降低心血管風(fēng)險等為主,常用的藥物以西藥居多,但治療時常出現(xiàn)副作用:西布曲明可能導(dǎo)致神經(jīng)性厭食癥,奧利司他可能導(dǎo)致脂溶性維生素缺失,噻嗪類利尿劑可能誘發(fā)胰島素抵抗從而升高血糖及三酰甘油水平,導(dǎo)致電解質(zhì)紊亂,β受體阻滯劑可能抑制胰島素分泌而誘發(fā)糖尿病。由于該病的影響因素較多,使療效難以滿意。中藥復(fù)方對MS的防治已廣泛應(yīng)用于臨床[8]。小檗堿作為常用藥物的主要有效成分,可發(fā)揮提高胰島敏感性、降低血糖、改善脂質(zhì)紊亂的作用[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是真核細(xì)胞中一種重要的亞細(xì)胞器,主要功能為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、折疊、運(yùn)輸及修飾,當(dāng)某些錯誤折疊蛋白的積聚引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一系列功能的紊亂,稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,是MS腎損害的重要發(fā)病機(jī)制之一[10]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)參與了這一病理過程[11],血尿酸(blood uric acid,UA)與MS腎損害密切相關(guān)[12]。本研究觀察中藥復(fù)方對MS大鼠空腹胰島素(FINS)水平、血脂含量、血UA及腎小管組織GRP78、CHOP表達(dá)的影響,以期為臨床診治MS大鼠腎損傷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 中藥復(fù)方:黃連15 g,黃芪20 g,地黃10 g,五味子10 g,蒼術(shù)15 g,茯苓15 g,麥冬10 g,共95 g,飲片均由江中飲片廠生產(chǎn),制成粗粉,與適量水煮沸30 min,粗濾,反復(fù)3次,濾液合并濃縮至30 mL,稀釋至0.2 g/mL水煎液備用。小檗堿溶液:精密稱取鹽酸小檗堿,以甲醇溶解并稀釋制成0.04 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 2月齡Wistar大鼠80只,飼養(yǎng)于動物中心清潔級動物室,體質(zhì)量160~180 g,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號:SYXK(鄂)2017-0067,由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會同意批準(zhǔn)實(shí)施。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循3R原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道關(guān)懷照顧。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 果糖(Amres-co,美國);鹽酸小檗堿(北京中新制藥廠,國藥準(zhǔn)字H11020962);鼠抗GRP78多抗(novus,貨號:H00003309-A01);兔抗CHOP mAb(Sino Biolgical,美國);山羊抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多抗(Sino Biolgical,美國)。
1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 小動物無創(chuàng)血壓測量儀購自上海欣軟科技有限公司;AU2700全自動生化分析儀購自日本Olympus公司;SMZ645型光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司。
1.2 方法
1.2.1 動物分組與模型建立 將80只2月齡Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、中藥組、小檗堿組,每組20只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,對照組予以普通飲食及飲用凈化自來水,其余大鼠用10%果糖水代替正常飲水,持續(xù)8周。8周后應(yīng)用兩因素重復(fù)測量方差分析,對血脂、血壓及空腹胰島素水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義的造模大鼠,認(rèn)為造模成功。用藥劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[12]中按“人與動物體表面積折算”,中藥組以中藥復(fù)方1.0 g/(kg·d)灌胃,每日1次;小檗堿組以小檗堿100 mg/(kg·d)灌胃,每日1次;對照組及模型組予以等體積生理鹽水灌胃,持續(xù)8周。干預(yù)8周后測量各組大鼠生化指標(biāo)、胰島功能、血壓水平。
1.2.2 大鼠尾動脈收縮壓測定 各組大鼠第2周開始于清醒、安靜狀態(tài)下,采用無創(chuàng)血壓測量儀,測量清醒狀態(tài)下大鼠尾動脈收縮壓。
1.2.3 血清指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠禁食12 h,麻醉后腹主動脈取血,采用酶比色法測定血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、UA和空腹血糖(FBG)含量;放射免疫法測定血清FINS水平。
1.2.4 樣本收集 斷頸處死各組大鼠,留取血液樣本,取一側(cè)腎臟,部分置于10%多聚甲醛中固定,-80 ℃冰箱保存。
1.2.5 腎臟組織病理學(xué)檢查 腎臟組織經(jīng)10%甲醛固定,乙醇脫水,石蠟包埋后,制成3 μm的石蠟切片,進(jìn)行蘇木精、糖原(PAS)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組腎臟微細(xì)結(jié)構(gòu)變化。
1.2.6 實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測GRP78、CHOP的mRNA表達(dá)水平 取冷凍的腎臟,用預(yù)冷的裂解液進(jìn)行組織勻漿,離心收集上清液,依次加入三氯甲烷及異丙醇進(jìn)行萃取,萃取后離心得到RNA沉淀,之后用75%乙醇洗滌2次后晾干,加入DEPC水溶解得到RNA溶液,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法將其合成為cDNA。依據(jù)設(shè)計的GRP78、CHOP引物,采用RT-PCR試劑盒及基因特異性引物進(jìn)行反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)曲線計算mRNA表達(dá)量,以GAPDH為內(nèi)參,以各條帶光密度與GAPDH條帶的比值作為相對表達(dá)量。引物序列見表1。
表1 引物序列
2.1 各組大鼠生化指標(biāo)及收縮壓比較 與對照組大鼠比較,模型組大鼠FBG、FINS、TG、TC、收縮壓、BUN及Scr水平均升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組和小檗堿組生化指標(biāo)及收縮壓均有不同程度下降,且中藥組下降程度更顯著(P<0.05)。詳見表2。
2.2 各組大鼠腎臟微細(xì)結(jié)構(gòu)變化 與對照組比較,模型組大鼠腎小球局灶節(jié)段性系膜基質(zhì)增多,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少;中藥組、小檗堿組大鼠腎組織病理改變均較模型組輕微,其中中藥組大鼠僅見輕度系膜細(xì)胞增生和基質(zhì)增多,腎小管炎性細(xì)胞浸潤基本消失;小檗堿組大鼠腎組織病理僅見少量系膜細(xì)胞增生。詳見圖1。
圖1 各組大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色,×400)
2.3 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達(dá)水平比較 模型組GRP78、CHOP mRNA表達(dá)高于對照組(P<0.01);與模型組相比,中藥組和小檗堿組GRP78、CHOP mRNA表達(dá)減少(P<0.05),且中藥組表達(dá)少于小檗堿組(P<0.05)。詳見圖2、表3。
圖2 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達(dá)條帶圖
表3 各組大鼠腎組織GRP78、CHOP mRNA表達(dá)水平比較(±s)
有研究顯示,MS作為一種代謝性疾病,其發(fā)病率及致死率均逐步升高,威脅我國人民的健康[13]。目前治療MS無標(biāo)準(zhǔn)指南,臨床主要是針對各項(xiàng)危險因素進(jìn)行有效干預(yù)。中醫(yī)學(xué)以預(yù)防腎損害為主,充分體現(xiàn)了未病先防、既病防變的治未病思想和理念。中醫(yī)藥治療或改善MS諸癥,取得了一定的療效,相關(guān)中藥復(fù)方和活性成分的研究和新藥開發(fā)取得了一定程度的進(jìn)展[14]。有研究顯示,從黃連中提取出的小檗堿通過降糖、降脂、糾正代謝紊亂等改善胰島素抵抗,達(dá)到防治MS的目的,黃連中的多種復(fù)合成分針對MS的多靶點(diǎn)治療優(yōu)于小檗堿已被證實(shí)[15]。有研究通過超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)探討黃芪湯中的潛在活性成分,鑒定出了17種提示腎病綜合征的生物標(biāo)志物,同時,篩選出治療腎病綜合征的活性成分,如芬芳因G加氫、粉防己堿、芳膽堿、甘草酸等[16],中藥復(fù)方在治療MS中發(fā)揮了重要作用。
本研究結(jié)果顯示,中藥復(fù)方、小檗堿均能降低MS大鼠FBG、FINS、TG、TC、收縮壓、BUN、UA及Scr水平,其中,中藥組各指標(biāo)水平降低更顯著;顯微鏡觀察可見中藥組大鼠腎組織病理改變較MS大鼠顯著改善,說明中藥復(fù)方對減輕MS大鼠的腎損害有確切的療效。GRP78在緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面發(fā)揮著重要的作用,GRP78表達(dá)上調(diào)具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性,可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性因子[17]。早期研究發(fā)現(xiàn),以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射引起正常小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并導(dǎo)致腎臟功能損害,而CHOP mRNA敲除小鼠存在嚴(yán)重的腎臟損害[18]。因此,推測腎功能損害與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的CHOP有關(guān),CHOP是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致細(xì)胞損傷的重要轉(zhuǎn)錄因子[19]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,中藥組、小檗堿組大鼠腎組織GRP78及CHOP mRNA表達(dá)均有不同程度減少,其中,中藥組兩種基因表達(dá)減弱顯著,接近對照組大鼠。為此提出假說,中藥復(fù)方可能通過調(diào)節(jié)GRP78及CHOP基因的表達(dá)而作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),以此減輕MS誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激腎臟細(xì)胞損傷而發(fā)揮作用。分析原因可能與中藥復(fù)方的藥理作用有關(guān)。詹玫琦等[20]實(shí)驗(yàn)研究顯示,黃連可改善大鼠糖脂代謝紊亂,降低血糖和血脂及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)。Zhou等[21]研究證實(shí),黃連堿通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激,減輕內(nèi)皮功能障礙,改善血管功能,從而減輕細(xì)胞損傷。張曉鳳等[22-23]研究發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷可降低高糖誘導(dǎo)的GRP78、CHOP高表達(dá),抑制H9c2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,緩解CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞過度凋亡,從而改善MS誘導(dǎo)的大鼠腎臟細(xì)胞凋亡。藥理研究發(fā)現(xiàn),地黃具有抗氧化、抗凋亡等作用,其有效成分可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,減少細(xì)胞損傷[24-25]。Cheng等[26-27]研究顯示,采用不同濃度的五味子乙素干預(yù)后,細(xì)胞相對存活率升高,且GRP78、CHOP水平降低,提示五味子乙素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕細(xì)胞損傷。王清華等[28]研究顯示,蒼術(shù)可減輕細(xì)胞炎性水腫,降低細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞介質(zhì)含量和細(xì)胞內(nèi)GRP78高表達(dá),抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。多項(xiàng)研究顯示,茯苓的有效成分如茯苓多糖、茯苓酸等均可抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,減輕炎癥反應(yīng)[29-30]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,麥冬皂苷D可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,對細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[31]。
中藥復(fù)方治療MS所致腎損害,調(diào)節(jié)GRP78及CHOP基因的表達(dá),有可能成為干預(yù)和治療MS的有效措施,為MS腎損害的治療提供新思路和新方法。