鄭興昊 李清 沈鋒 楊貴霞 李想 肖川

1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（貴陽(yáng) 550004）；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科（貴陽(yáng) 550002）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）基本病理改變?yōu)榉闻菝?xì)血管損傷、肺水腫及后期的肺組織纖維化等[1]。頑固性低氧血癥是引起ARDS相關(guān)性多器官功能障礙（MODS）及死亡的重要原因。研究[2-3]表明，在ARDS疾病中存在肺泡促凝亢進(jìn)和纖溶抑制，引起肺血管內(nèi)廣泛微血栓、肺泡大量纖維蛋白沉積，導(dǎo)致肺泡死腔增多、通氣血流比例（V/Q）失調(diào)等，引起ARDS頑固性低氧血癥[4-5]。因此，針對(duì)上述改變，研究有效藥物，有望改善ARDS治療結(jié)局。大黃素（Emodin，ED）是天然的蒽醌衍生物[6]，被廣泛應(yīng)用于治療流感、敗血癥等疾病[7-10]。既往研究[11-13]表明，ED能通過抑制NF-κB信號(hào)通路減輕肺損傷。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，ED能有效改善LPS引起的ARDS肺泡過度促凝和纖溶抑制狀態(tài)，抑制肺組織過度炎癥反應(yīng)，具有較好肺保護(hù)作用[14]，但它的作用機(jī)制不清楚。而肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AECⅡ）對(duì)肺泡纖溶抑制及促凝有非常重要的調(diào)控效用[15]。本文以AECⅡ?yàn)橹饕芯繉?duì)象，觀察ED對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下該細(xì)胞中促凝和纖溶抑制相關(guān)因子的影響，探索該藥作用環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑選用大鼠AECⅡ細(xì)胞株（中南大學(xué)細(xì)胞庫(kù)），LPS、ED（Sigma公司）；組織因子（TF）一抗（美國(guó) NOVUS公司），3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗（中國(guó)武漢），組織因子途徑抑制劑（TFPI）、纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）一抗和二抗（美國(guó) Abcam），TFPI、PAI-1、TF引物序列（中國(guó)上海）；凝血酶抗凝血酶復(fù)合物（TAT）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、Ⅲ型前膠原肽（PⅢP）及APC的ELISA試劑盒（上海）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理將傳代培養(yǎng)的AECⅡ細(xì)胞分為5組。正常對(duì)照（NC）組：不做任何處理常規(guī)培養(yǎng)；LPS組：參考前期研究方法[15]對(duì)細(xì)胞進(jìn)行LPS處理；不同劑量ED組：加入ED 0.25、0.5及1 μg/mL處理細(xì)胞1 h，然后加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）篩選ED的最佳濃度取AECⅡ細(xì)胞懸液加入96孔板，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的ED溶液并培養(yǎng)24 h。換液后加入10%CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。選取與空白組相近細(xì)胞活力的ED濃度作為研究濃度。

1.4 Western blotting檢測(cè) TF、TFPI、PAI-1的蛋白表達(dá)收集處理完畢的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，高速低溫離心，收集上清液，按Western blotting檢測(cè)試劑盒操作說明檢測(cè)TF、TFPI、PAI-1蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)AECⅡ細(xì)胞中TF、TFPI、PAI-1的mRNA表達(dá)收集處理完畢的細(xì)胞，加入Trizol裂解液裂解，離心；根據(jù)RT-qPCR方法進(jìn)行操作。選用2-ΔΔCt法計(jì)算所需基因的表達(dá)量。

1.6 ELISA檢測(cè)上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP的水平取一定量的AECⅡ細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定A值時(shí)選用波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀，選取標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到AECⅡ細(xì)胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad Prism9.0軟件作圖并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組別間的比較選用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性時(shí)組別間的均數(shù)間兩兩比較使用 SNK-q（Student-Newman-Keuls）檢驗(yàn)法，當(dāng)方差不齊時(shí)使用Tamhane's T2檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法篩選ED的最佳濃度如圖1所示，分別予0.25、0.5、1、2、4 μg/mL 5個(gè) ED濃度培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)ED濃度達(dá)到1 μg/mL后細(xì)胞增殖呈逐漸下降趨勢(shì)，故選1 μg/mL的劑量濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的最高劑量。

圖1 CCK8實(shí)驗(yàn)中各組AECⅡ細(xì)胞的活性Fig.1 Activity of AECⅡcells in each group in CCK8 experiment

2.2 ED劑量依賴性改善AECⅡ細(xì)胞中PAI-1、TFPI、TF的蛋白表達(dá)使用LPS刺激以后，細(xì)胞中TF和PAI-1的蛋白表達(dá)量顯著增加，TFPI蛋白表達(dá)顯著減少（均P＜0.05）。ED劑量依賴性逆轉(zhuǎn)了PAI-1、TF和TFPI的蛋白改變（均P＜ 0.05）（圖2，表1）。

圖2 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠AECⅡ細(xì)胞中PAI-1、TFPI、TF的蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expressions of PAI-1，TFPI and TF in AECⅡcells were detected by Western blotting

表1 各組AECⅡ細(xì)胞中TF、TFPI、PAI-1的蛋白表達(dá)比較Tab.1 Comparison of TF，TFPI and PAI-1 protein expression in AECⅡ cells of each group ±s

表1 各組AECⅡ細(xì)胞中TF、TFPI、PAI-1的蛋白表達(dá)比較Tab.1 Comparison of TF，TFPI and PAI-1 protein expression in AECⅡ cells of each group ±s

注：NC組是正常對(duì)照組，LPS組是脂多糖損傷刺激組，L-ED組、M-ED組、H-ED組分別是ED 0.25、0.5、1 μg/mL組；與NC組比較，a P ＜0.05；與LPS組比較，b P ＜0.05；與 L-ED組比較，c P ＜0.05；與M-ED組比較，d P＜0.05，F(xiàn)為兩個(gè)均方的比值（效應(yīng)項(xiàng)/誤差項(xiàng)）

樣本數(shù)（個(gè)）3 3 3 3 3組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值TF/GAPDH 0.25±0.02 0.80±0.02a 0.57±0.01ab 0.46±0.01abc 0.38±0.01abcd 728.3＜0.000 1 TFPI/GAPDH 0.59±0.01 0.31±0.03a 0.40±0.01ab 0.45±0.02ab 0.51±0.04ab 52.52＜0.000 1 PAI-1/GAPDH 0.31±0.03 0.85±0.04a 0.63±0.08ab 0.52±0.04ab 0.45±0.01ab 56.28＜0.000 1

2.3 ED劑量依賴性改善AECⅡ細(xì)胞PAI-1、TF、TFPI的mRNA表達(dá)使用LPS刺激AECⅡ細(xì)胞后其TF和PAI-1的mRNA表達(dá)量顯著增加，TFPI mRNA表達(dá)量顯著減少（均P＜0.05）。使用不同劑量ED培養(yǎng)的細(xì)胞TF和PAI-1的mRNA表達(dá)量都較LPS組劑量依賴性減少，TFPI劑量依賴性增加（P＜0.05），如表2所示。

表2 各組AECⅡ細(xì)胞TF、TFPI、PAI-1 mRNA表達(dá)比較Tab.2 Comparison of TF，TFPI，PAI-1 mRNA expression in AECⅡcells of each group ±s

表2 各組AECⅡ細(xì)胞TF、TFPI、PAI-1 mRNA表達(dá)比較Tab.2 Comparison of TF，TFPI，PAI-1 mRNA expression in AECⅡcells of each group ±s

注：NC組是正常對(duì)照組，LPS組是脂多糖損傷刺激組，L-ED組、M-ED組、H-ED組分別是ED 0.25、0.5、1 μg/mL組；與NC組比較，a P ＜0.05；與LPS組比較，b P ＜0.05；與 L-ED組比較，c P ＜0.05；與M-ED組比較，d P＜0.05，F(xiàn)為兩個(gè)均方的比值（效應(yīng)項(xiàng)/誤差項(xiàng)）

組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值樣本數(shù)（個(gè)）3 3 3 3 3 TF 0.45±0.01 2.47±0.02a 2.00±0.01ab 1.36±0.07abc 1.02±0.06abcd 1072＜0.000 1 TFPI 1.00±0.06 0.26±0.01a 0.51±0.02ab 0.62±0.01abc 0.70±0.02abcd 261.0＜0.000 1 PAI-1 1.00±0.04 2.63±0.01a 2.39±0.03ab 2.06±0.04abc 1.84±0.10abcd 367.9＜0.000 1

2.4 ED劑量依賴性改善AECⅡ細(xì)胞上清液中TAT、AT-Ⅲ、APC及PⅢP水平LPS刺激后，AECⅡ細(xì)胞上清液中AT-Ⅲ、APC水平顯著少于NC組，PⅢP、TAT水平顯著多于NC組（均P＜0.05）。ED劑量依賴性逆轉(zhuǎn)了上述因子的水平（均P＜0.05），如表3所示。

表3 各組AECⅡ細(xì)胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平比較Tab.3 Comparison of APC，AT-Ⅲ，TAT，PⅢ P levels in the supernatant of AECⅡcells in each group ±s

表3 各組AECⅡ細(xì)胞上清液中APC、AT-Ⅲ、TAT、PⅢP水平比較Tab.3 Comparison of APC，AT-Ⅲ，TAT，PⅢ P levels in the supernatant of AECⅡcells in each group ±s

注：NC組是正常對(duì)照組，LPS組是脂多糖損傷刺激組，L-ED、M-ED、H-ED組分別是ED 0.25、0.5、1 μg/mL組；與NC組比較，a P ＜0.05；與LPS組比較，b P ＜0.05；與 L-ED組比較，c P ＜0.05，F(xiàn)為兩個(gè)均方的比值（效應(yīng)項(xiàng)/誤差項(xiàng)）

組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值組別NC組LPS組L-ED M-ED H-ED F值P值樣本數(shù)（個(gè)）3 3 3 3 3樣本數(shù)（個(gè)）3 3 3 3 3 APC（ng/mL）1 421.80±40.49 998.19±8.95a 1 095.85±4.53ab 1 234.42±26.37abc 1 296.48±47.2abc 88.96＜0.000 1 TAT（ng/mL）9.93±0.40 17.69±0.23a 13.85±0.72ab 13.36±0.89abc 11.80±0.37ab 72.09＜0.000 1 AT-Ⅲ（ng/mL）131.41±2.16 77.72±2.77a 90.85±3.24ab 114.42±3.70abc 118.94±3.21abc 153.2＜0.000 1 PⅢP（ng/mL）185.50±1.27 280.81±10.99a 241.48±9.35ab 221.44±5.52abc 214.31±4.29ab 74.50＜0.000 1

2.5 ED對(duì)細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)的影響為了觀察大黃素預(yù)處理對(duì)LPS刺激下細(xì)胞核內(nèi)p65表達(dá)，我們使用免疫熒光法測(cè)定細(xì)胞核中p65水平。結(jié)果如圖3所示，ED預(yù)處理明顯降低了細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白熒光染色。

圖3 AECⅡ細(xì)胞核中p65的檢測(cè)Fig.3 Detection of p65 in the nucleus of AECⅡ

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用既往LPS濃度（5 μg/mL）刺激肺泡上皮細(xì)胞[16]，模擬革蘭陰性桿菌誘導(dǎo)ARDS細(xì)胞模型。通過LPS刺激AECⅡ細(xì)胞后，使得其PAI-1、TF的表達(dá)水平均明顯升高，TFPI表達(dá)水平則明顯降低；細(xì)胞上清液中ATⅢ、APC含量均明顯減少，PⅢP、TAT含量則明顯增加，與我們前期結(jié)果一致[15-16]。ED預(yù)處理AECⅡ細(xì)胞，可明顯抑制LPS刺激引發(fā)的TF、PAI-1表達(dá)增加，促成TFPI表達(dá)；另一方面又可明顯減少細(xì)胞上清液中PⅢP、TAT水平，增加APC、AT-Ⅲ含量。提示ED能有效逆轉(zhuǎn)LPS刺激引起的促凝和纖溶抑制因子的變化。

TF是較強(qiáng)的促凝因子，其異常表達(dá)在血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化和急性冠脈綜合征等凝血疾病中起重要作用[17-18]。TFPI是TF的生理抑制劑，通過抑制TF-FVIIa復(fù)合物形成來抑制TF誘導(dǎo)的凝血[19-20]。PAI-1是主要的纖溶抑制劑，抑止纖維蛋白溶解從而增加纖維蛋白沉積[21]。ATⅢ由SerpinC1基因編碼[22]，與內(nèi)皮細(xì)胞表面的肝素樣物質(zhì)相互作用起抗凝作用。蛋白C的活性形式為APC，具有強(qiáng)大的抗凝血活性[23]。TAT 代表凝血酶生成量，可用于評(píng)估機(jī)體的凝血激活狀態(tài)[24]。機(jī)體組織纖維化的程度則是通過PⅢP反映的，它的變化決定了體內(nèi)纖維組織的含量[25]。本研究提示，ED預(yù)處理明顯抑制了LPS刺激下AECⅡ細(xì)胞表達(dá)及分泌纖溶抑制因子和促凝，而增加抗凝因子的水平，提示ED具有糾正LPS刺激下AECⅡ細(xì)胞促凝和纖溶抑制因子表達(dá)的失衡，與我們前期結(jié)果相符合[14]。本文結(jié)果還表明AECⅡ細(xì)胞是ED作用靶點(diǎn)之一。免疫熒光提示LPS刺激導(dǎo)致細(xì)胞核中p65蛋白熒光染色增強(qiáng)，表明LPS刺激促進(jìn)了p65的核移位。ED卻顯著降低了細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白水平，提示該藥的作用與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

本研究事先通過CCK-8確定了ED的安全劑量范圍。因此，可排除藥物本身對(duì)細(xì)胞的毒性作用。在所選取的劑量范圍內(nèi)，隨著劑量增大，ED的作用逐漸增加，提示該藥的作用效果可能存在一定劑量依賴關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)的不足：（1）基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用存在一定的差異，本研究通過LPS刺激[13]AECⅡ細(xì)胞對(duì)纖溶和凝血反應(yīng)得到的結(jié)果不一定完全與臨床相符，因此還需更深入的臨床研究證實(shí)；（2）對(duì)于ED劑量的選擇可進(jìn)一步優(yōu)化；（3）對(duì)于ED的作用機(jī)制未能明確說明。

綜上所述，ED在一定程度上抑制了LPS刺激下Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)及分泌纖溶抑制因子和促凝的能力，該作用可能與其抑制NF-κB信號(hào)通路活化有關(guān)。