詹宇威，林書典，詹 鋒，黃艷艷，楊 舟

0 引 言

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性全身炎癥性疾病，其特點是關節(jié)疼痛和腫脹，是致殘的主要原因，嚴重威脅著人們的生命健康和生活質量[1-2]。該疾病的發(fā)病出現在任何年齡，但40～60歲是風險最大的年齡組[3]。目前，對RA的治療主要是為了緩解疼痛以及炎癥反應，以提高RA患者的生活質量[4]。研究顯示，靶向免疫療法和積極的治療策略極大地改善了臨床結果[5]，但目前仍無治愈方法。因此，闡明其潛在的分子機制對于開發(fā)新的RA治療策略至關重要。

顆粒酶B(Granzyme B，GZMB)是一種絲氨酸蛋白酶, 在NK細胞或細胞毒性T淋巴細胞表達[6]。目前，GZMB已被證明參與多種病理過程，包括抗腫瘤免疫以及病毒感染等[7-8]。例如，先前的研究表明，GZMB能夠通過直接水解致病所必需的病毒蛋白而抑制病毒復制，從而促進抗病毒免疫[9]。更重要的是，多項研究報道GZMB在類風濕關節(jié)炎中高表達，并且其表達水平和RA的發(fā)生進展相關[10-11]。但其在類風濕關節(jié)炎中發(fā)揮作用的機制尚不完全清楚。

絲甘蛋白聚糖(serglycin，SRGN)作為一種造血細胞顆粒蛋白聚糖，是細胞內唯一具有與多種生物分子相互作用能力的蛋白多糖，主要表達于血細胞、內皮細胞、腫瘤細胞和胚胎干細胞[12-13]。SRGN參與多種造血或非造血細胞中炎癥介質的儲存和分泌[14-15]，因此，SRGN過量產生與炎癥機制的擴大和進展有關，例如，在人類造血和非造血腫瘤中，SRGN增強炎癥反應，促進腫瘤生長和轉移，其增加與預后不良相關[16]。此外，有研究發(fā)現在非小細胞肺癌中SRGN通過CD44/NF-kappaB/CLDN1軸促進上皮間質轉化和腫瘤的侵襲轉移[17]；SRGN直接參與調節(jié)非感染性軟骨細胞損害的機制，SRGN敲低細胞中，特異性炎癥標志物和NF-kappaB激活顯著降低[18]，而NF-kappaB作為炎癥相關的重要通路能夠促進GZMB表達[19]。因此，我們推測GZMB可能通過SRGN/NF-kappaB信號通路類風濕關節(jié)炎中發(fā)揮作用。綜上所述，本研究旨在探究GZMB對RA-FLSs的增殖和炎癥反應的影響以及其潛在的分子機制，為炎癥性關節(jié)炎的治療提供新的靶點和策略。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(批號：PI330)，IL-1β ELISA試劑盒(批號：PI305)以及IL-8 ELISA試劑盒(批號：PI640)，均購自碧云天生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Thermo Fisher(中國)。TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(中國Thermo Fisher公司)，cDNA合成試劑盒(日本TaKaRa公司)，LipofectamineTM 2000 (美國Invitrogen公司)。RIPA裂解緩沖液(中國Beyotime公司)，EdU檢測試劑盒(中國Beyotime公司)。GZMB兔單克隆抗體(abcam，批號：ab108531)，SRGN兔多克隆抗體(AtaGenix，批號：ATA37978)，P65兔單克隆抗體(abcam，批號：ab32536)。p-p65兔單克隆抗體(abcam，批號：ab183559)，P50兔多克隆抗體(abcam，批號：ab209795), GAPDH兔多克隆抗體(abcam，批號：ab9485)以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔lgG二抗(abcam，批號：ab6721)。

1.2細胞培養(yǎng)正常人的滑膜細胞(NC-FLSs)以及類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞(RA-FLSs)，均購自Jennio生物技術公司(中國廣州)。上述細胞置于含有20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)以及1%的青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的細胞用作后續(xù)實驗。

1.3細胞轉染為了使GAMB和SRGN過表達以及敲低GAMB的表達，GAMB過表達(Oe-TSHR)以及SRGN過表達(Oe-SRGN)和過表達陰性對照(Oe-NC)由上海吉凱基因科技有限公司合成，si-GAMB干擾序列及其陰性對照(si-NC)購自廣州銳博生物，并按照脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000說明書分別轉染至對應細胞分組中。qRT-PCR和Western blot檢測轉染效率。

1.4CCK-8檢測細胞活力將處理后的各組細胞接種于96孔板中，細胞密度為5×103/孔。培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后，向每孔細胞中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h后，使用VarioskanTMLUX多功能酶標儀檢測波長450 nm處的細胞光密度值(A值)評估細胞活力。該實驗獨立重復3次。

1.5EdU檢測細胞增殖使用BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒 (C0071S, 碧云天生物科技有限公司)，通過5-乙基-2'-脫氧尿苷(EdU)摻入檢測RA-FLSs細胞的增殖。在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野拍攝圖像，并獨立重復進行3次。

1.6免疫共沉淀實驗(COIP)使用RIPA裂解緩沖液分離細胞總蛋白，并使用BCA試劑盒進行蛋白定量。400 μg蛋白與2 μg SRGN抗體在4 ℃孵育過夜。隨后，加入30 μL Protein G/A瓊脂糖珠孵育細胞4 ℃下孵育1h。PBS洗滌3次后，將沉淀蛋白在5 × SDS-PAGE上樣緩沖液中重懸。最后，使用免疫印跡法(Western blot)進行檢測。實驗重復3次。

1.7逆轉錄定量PCR(RT-qPCR)使用Trizol(Invitrogen)按照制造商的方案從細胞中提取總RNA。使用反轉錄系統(tǒng)試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。按照制造商的方案使用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen，Germany)進行RT-qPCR。以GAPDH為內參進行歸一化處理，結果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量的差異。獨立重復3次。實驗所用引物見表1。

表 1 PCR引物序列信息

1.8蛋白質免疫印跡(Western blot)收集各個處理組細胞用預冷的RIPA細胞裂解緩冰上裂解10 min后，將等量蛋白于100V進行SDS-PAGE。電泳結束后，以60 V、120 min將蛋白遷移至PVDF膜，一抗4 ℃過夜孵育，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min后，加辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG，室溫下孵育120 min，之后用ECL試劑盒(Solarbio，Beijing，China)進行發(fā)光反應，拍照觀察蛋白印記。以GAPDH為內參照，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，實驗重復進行3次。

1.9酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-1β、IL-6以及IL-8水平將處于對數生長期的RA-FLSs細胞接種于24孔板中，收集各組細胞上清培養(yǎng)液，隨后按照試劑盒說明書檢測促炎因子IL-1β、IL-6以及IL-8的水平，多功能酶標儀于450 nm處測定吸光度，實驗重復進行3次。

1.10統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism8.0進行統(tǒng)計學分析，定量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，并使用Tukey檢驗方法。以P≤0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GZMB在RA-FLSs 細胞中表達上調首先，通過GEO數據庫的檢索，獲取RA患者滑膜組織芯片數據(GSE153015)，以OA synovium large joint為對照，RA患者synovium large joint為實驗組進行GEO2R差異分析，獲得差異表達基因；隨后對差異表達基因導入進行PPI網絡分析篩選出HUB基因(CXXL10、GZMB、CCL5、CD27、CCR2、CD38、CD274、IRF4、CXCL9和CXCL11)；此外，采用RT-qPCR和Western blot檢測RA-FLSs 細胞中GZMB的表達(圖1c-d)，結果發(fā)現，與正常人的滑膜細胞(NC-FLSs)相比，GZMB在RA-FLSs 細胞中高表達(P<0.01)。見圖1。

a：GEO2R分析獲得差異表達基因；b：PPI網絡分析篩選HUB基因；c：蛋白質免疫印跡檢測GZMB蛋白表達；d：逆轉錄定量PCR檢測GZMB mRNA表達

2.2GZMB調節(jié)RA-FLSs的增殖和炎癥反應構建GZMB過表達和干擾質粒轉染至RA-FLSs細胞，采用Western blot和RT-qPCR檢測過表達或干擾效率，結果顯示，與對照組相比，GZMB在過表達后蛋白和mRNA水平顯著上調，反之，在干擾后，GZMB的表達顯著下調(P<0.01)。CCK-8以及EdU實驗檢測細胞增殖的結果顯示，與對照組相比，過表達GZMB顯著地促進了細胞增殖，而干擾GZMB的表達后，細胞增殖受到抑制(P<0.01)。隨后，采用ELISA實驗檢測炎癥相關因子的表達，結果發(fā)現與對照組相比，過表達GZMB顯著地上調了IL-1β、IL-6以及IL-8的水平(P<0.01)，同樣地，GZMB的敲除降低了上述炎癥因子的表達(P<0.05)。見圖2。

2.3GZMB與SRGN相結合通過GeneMANIA網站的分析獲得與GZMB相關基因。將其相關基因與deRNA取交集得到6個交集基因(GZMA、SRGN、HOPX、GZMH、BIRC3、GNLY。我們選擇SRGN進行下一步研究。string數據庫的分析結果顯示GZMB和SRGN可能相結合。采用和Western blot和RT-qPCR檢測RA-FLSs 細胞中SRGN的表達，結果顯示與NC-FLSs組相比，在RA-FLSs 細胞中高表達(P<0.01)。Western blot實驗驗證GZMB和SRGN之間的關系，結果如圖3f所示，與對照組相比，GZMB過表達增加了細胞中SRGN的表達，而在GZMB敲除的細胞中，SRGN的表達被明顯抑制(P<0.01)。免疫共沉淀的結果顯示，在利用IgG進行沉淀實驗時，SRGN與GZMB蛋白并未出現明顯沉淀，表明蛋白SRGN或GZMB不能與IgG結合，但使用GZMB或SRGN誘導沉淀時，對應蛋白均出現了明顯的沉淀印跡，由此表明GZMB能夠與SRGN相結合。見圖3。

a：蛋白質免疫印跡檢測GZMB蛋白表達水平；b：逆轉錄定量PCR檢測GZMB的mRNA表達；c：CCK-8用于檢測細胞活力；d：EdU檢測細胞增殖；e：IL-1β表達水平；f：IL-6表達水平；g：IL-8表達水平

2.4GZMB調控SRGN參與NF-kappaB信號通路Western Blot檢測結果見圖4，與si-NC + oe-NC組相比，干擾GZMB顯著降低了GZMB、SRGN、P65、p-p65和p50蛋白的表達水平(P<0.01)，然而，進一步過表達SRGN也逆轉了GZMB敲除對NF-kappaB信號通路相關蛋白(GZMB、SRGN、p65、p-p65和p50)的抑制作用(P<0.01)。見圖4。上述結果表明GZMB與SRGN互相作用并通過NF-kappaB信號通路調節(jié)RA-FLSs的增殖和炎癥反應。

a：GeneMANIA網站中GZMB相關基因的分析；b：GZMB相關基因與deRNA的交集；c：String數據庫檢索GZMB和SRGN相關性；d：蛋白質免疫印跡檢測SRGN蛋白表達水平；e：逆轉錄定量PCR檢測SRGND mRNA表達水平；f：過表達或干擾GZMB時，SRGN蛋白表達水平；g：免疫共沉淀實驗檢測GZMB和SRGN之間的相關性

a：蛋白質免疫印跡檢測NF-kappaB信號代表條帶；b：GZMB表達水平；c：SRGN表達水平；d：p65表達水平；e：p-p65表達水平；f：p50表達水平

2.5SRGN過表達逆轉GZMB敲除對RA-FLSs增殖和炎癥反應的促進作用構建SRGN過表達載體，Western blot和RT-qPCR分別檢測SRGN的過表達效率，與Oe-NC組相比，SRGN在Oe-SRGN組顯著上調(P<0.001)。CCK-8以及EdU實驗的結果顯示，與si-NC +oe-NC組相比，干擾GZMB有效地抑制了細胞增殖(P<0.01)，而過表達SRGN后逆轉了GZMB敲除對細胞增殖的抑制作用(P<0.01)。同樣地，ELISA的結果也顯示SRGN過表達逆轉了GZMB敲除對IL-1β、IL-6以及IL-8的表達的抑制作用(P<0.01)。見圖5。

a：蛋白質免疫印跡檢測SRGN蛋白表達水平；b：逆轉錄定量PCR檢測SRGN mRNA表達；c：CCK-8法檢測細胞活力；d：通過EdU測定檢查細胞增殖；e：IL-1β表達水平；f：IL-6表達水平；g：IL-8表達水平

3 討 論

目前RA仍是一種病因未明的慢性系統(tǒng)性疾病，主要伴有關節(jié)軟骨及周圍組織的破壞，以滑膜增生以及炎性滑膜炎為特征[20-21]。在本研究中，我們利用GEO數據庫獲取RA患者滑膜組織芯片數據并進行GEO2R差異分析，將獲得的差異表達基因導入String數據庫進行PPI網絡分析，發(fā)現GZMB與類風濕關節(jié)炎的發(fā)病顯著相關。隨后，我們檢測GZMB在RA-FLSs細胞中的表達發(fā)現GZMB在RA-FLSs 細胞中表達上調。通過構建GZMB過表達和干擾質粒，發(fā)現過表達GZMB顯著地促進了RA-FLSs細胞增殖和炎癥反應，而GZMB基因沉默有效地降低了RA-FLSs細胞中炎癥因子IL-6、IL-1β和IL-8水平，抑制RA-FLSs細胞異常增殖，我們的結果提示GZMB基因沉默可能在RA滑膜增生和關節(jié)軟骨損傷中發(fā)揮重要作用，這與Bao等[6]研究GZMB基因沉默對RA的影響的結果一致。

為進一步探索GZMB在類風濕關節(jié)炎中發(fā)揮作用的機制，通過GeneMANIA在線分析(http://genemania.org/)，發(fā)現SRGN是GZMB相關基因，String數據庫的進一步驗證顯示GZMB和SRGN之間存在相互作用，隨后的免疫共沉淀實驗結果也驗證了這一點。SRGN是一種低分子量糖蛋白，主要在造血細胞中表達，分泌并整合到細胞外基質中[22]。SRGN在許多細胞因子、趨化因子和蛋白酶的儲存和分泌中發(fā)揮重要作用，因此參與許多生理和病理過程[23]。研究證實，SRGN在結直腸癌、非小細胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌和乳腺癌中促進腫瘤侵襲和轉移[17,24-25]。SRGN還通過調節(jié)TNF-α等多種炎癥介質并激活NF-kappaB信號通路參與炎癥過程[18]。眾所周知，NF-kappaB是一個典型的炎癥信號通路，主要基于促炎細胞因子如白細胞介素和腫瘤壞死因子對NF-kappaB的激活[26]，重要的是，NF-kappaB同時也是促進GZMB的表達的轉錄因子[19]。在本研究中，我們的結果顯示，SRGN在RA-FLSs 細胞中高表達，進一步過表達SRGN逆轉了GZMB干擾對RA-FLSs細胞增殖，炎癥反應以及NF-kappaB信號通路相關蛋白的抑制作用，表明GZMB通過SRGN/NF-kappaB信號通路調節(jié)類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖和炎癥反應。

綜上所述，本研究首次揭示了GZMB與SRGN在類風濕關節(jié)炎中的相互作用關系，闡明了GZMB通過SRGN/NF-kappaB信號通路調節(jié)類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖和炎癥反應的作用機制，該研究為類風濕關節(jié)炎的臨床治療藥物提供了新的治療靶點和策略。