童宇軒，楊志惠，汪少華

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川 瀘州 646000）

exosomes是直徑約為3～100 nm的小囊泡，不同來源的活細(xì)胞均可分泌[1-3]。其中，腫瘤細(xì)胞來源的exosomes包含許多腫瘤相關(guān)的抗原，如TSG101、Alix、Hsp60、Hsp70、Hsp90和CD9等免疫分子，其可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，起到抑制腫瘤的作用[4]。腫瘤細(xì)胞也能分泌exosomes瘤苗，并誘導(dǎo)特異性免疫效應(yīng)，其抗腫瘤作用已在老鼠和人身上得到證實[5]，但腹水來源的exosomes是否也可作為腫瘤疫苗誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞反應(yīng)、抑制腫瘤生長尚不明確。因此，本研究首先通過超速離心分別獲得腹水來源的exosomes和小鼠肝癌細(xì)胞H22來源的exosomes，然后在小鼠肝癌皮下移植瘤模型體內(nèi)探索exosomes作為腫瘤疫苗激活機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)的價值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及動物 小鼠肝癌H22細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室惠贈，本室復(fù)蘇后保存。6～8周齡的BALB/c小鼠（18±2）g購于重慶醫(yī)科大學(xué)的醫(yī)學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±2）℃，濕度（50±10）%，12 h 明暗交替。本研究通過動物倫理審批。

1.2 試劑 胎牛血清（中國杭州四季青生物醫(yī)學(xué)公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；小鼠淋巴細(xì)胞分離液（中國天津TBD生物公司）；小鼠血清IL-2和INF-γ的ELISA檢測試劑盒（中國廣州晶美生物醫(yī)學(xué)公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma公司）。

1.3 實驗儀器 倒置顯微鏡（日本Nikon）；精密電子天平（中國北京塞多利斯儀器廠JA5003型）；CO2培養(yǎng)箱（美國NURARE)；無菌超凈工作臺（中國蘇州凈化公司）；LTP-C型離心涂片機（中國北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；臺式低溫高速離心機（德國Heareus，Biofuge 15R型）。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 取出液氮凍存的小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞，于37 ℃按步驟進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，加入培養(yǎng)液，放置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)進(jìn)行半開口的單層細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4.2腹水瘤動物模型的建立 首先將H22細(xì)胞系按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的方式培養(yǎng)、傳代，取其對數(shù)生長期的細(xì)胞臺盼藍(lán)染色，于顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞。取0.2 ml（約含1×108個瘤細(xì)胞）在無菌條件下，分別注射進(jìn)6～8周的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，接種后給予常規(guī)飲水飲食。

1.4.3 腹 水 和H 2 2 細(xì) 胞 來 源e x o s o m e s 的 制 備BALB/c小鼠通過腹腔注射接種H22細(xì)胞，腹腔內(nèi)生長1周后，腹水生長旺盛，小鼠腹脹明顯，使用10 ml的注射器吸取腹水。操作在無菌臺進(jìn)行，抽腹水前后使用75%酒精消毒穿刺點附近皮膚。采用文獻(xiàn)[5]所述方法將抽取腹水按照超速離心法提取exosomes。然后，采用低溫超速分級離心和蔗糖密度梯度離心法純化提取H22細(xì)胞培養(yǎng)上清中的exosomes瘤苗。

1.4.4皮下移植瘤動物模型的建立 BALB/c小鼠H22細(xì)胞腹水瘤模型成功構(gòu)建1周后，腹水明顯，抽取腹水。用臺盼藍(lán)染色后，于顯微鏡下行腹水H22細(xì)胞計數(shù)。參照文獻(xiàn)使用無菌生理鹽水稀釋H22細(xì)胞，調(diào)整H22濃度為5×l06個/ml，然后每只小鼠右腋皮下注射接種H22細(xì)胞0.2 ml，從而構(gòu)建小鼠H22細(xì)胞皮下移植瘤模型。

1.4.5exosomes在移植瘤模型中的治療 構(gòu)建小鼠H22細(xì)胞皮下移植瘤模型的當(dāng)天，研究使用隨機的方法將18只小鼠分為腹水來源exosomes組、H22細(xì)胞系來源exosomes組、對照組，每組6只。腹水來源exosomes組：H22細(xì)胞接種當(dāng)天，在每只小鼠左后肢根部皮下接種腹水來源exosomes（10 μg/只），共給予3次，隔天一次；H22細(xì)胞系來源exosomes組：在小鼠左后肢根部皮下注射H22細(xì)胞系來源exosomes（10 μg/只），共給予3次，隔天一次；對照組：注入等量PBS。所有小鼠在接種H22細(xì)胞后的第15天處死，并且觀察各項實驗指標(biāo)。

1.4.6腫瘤抑制率計算 小鼠處死后，完整取出腫瘤瘤體，充分剝離干凈，再用濾紙拭去血污，用電子天平稱取瘤體重量，按文獻(xiàn)[7]所述方法計算抑瘤率。抑瘤率=（1-實驗組瘤重/對照組瘤重）×100%。

1.4.7脾臟和胸腺指數(shù)的檢測 小鼠處死后，無菌條件完整取出脾臟和胸腺后電子天平稱重，參考文獻(xiàn)[5]的方法，計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。小鼠脾（胸腺）指數(shù)=脾（胸腺）重量/體重（mg/g）。

1.4.8 MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖能力 參考文獻(xiàn)[8]，在無菌條件下迅速分離脾出淋巴細(xì)胞，將1×l05個/ml的淋巴細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，200 μl/孔，各組再加入100 μg/ml ConA溶液，5 μl/孔，用MTT法檢測檢測脾淋巴細(xì)胞增殖活性。陰性細(xì)胞對照組200 μl細(xì)胞懸液/孔+5 μlRPMI-1640培養(yǎng)液，空白對照組每孔加入205 μl RPMI-1640培養(yǎng)液，每組均設(shè)有3個復(fù)孔。放置于37 ℃，5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT（5 mg/ml），20 μl/孔，將培養(yǎng)板置于孵箱中再培養(yǎng)4 h后，取出離心，小心吸去上清，加二甲亞砜（DMSO）200 μl，在搖床上震蕩溶解10 min，用酶標(biāo)儀波長570 nm檢測每孔吸光度（A）值。所有實驗重復(fù)3次。計算公式：刺激指數(shù)（stimulation index，SI）=實驗組A值/陰性細(xì)胞對照組A值。刺激指數(shù)用來表示淋巴細(xì)胞的增殖活性。

1.4.9脾淋巴細(xì)胞殺傷實驗檢測 將H22細(xì)胞調(diào)整密度至1×l06個/ml，作為靶細(xì)胞，以小鼠脾淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，在96孔板中按效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞為20∶1、40∶1、80∶1，分別加入100 μl效應(yīng)細(xì)胞和100 μl靶細(xì)胞為實驗組，每組均設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照組、靶細(xì)胞對照組，將培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2孵箱中孵育12 h后，用MTT法在酶標(biāo)儀波長為570 nm檢測每孔吸光度（A）值。所有實驗重復(fù)3次。殺傷率計算公式（%）＝[1-（實驗組A值-效應(yīng)細(xì)胞A值）/靶細(xì)胞對照組A值]×100%。

1.4.10 ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子的變化 各組小鼠處死前先用4%的水合氯醛腹腔麻醉，用摘眼球的方式獲取外周血0.6 ml，無需抗凝，3000 rpm/30 min，獲得血清標(biāo)本，應(yīng)用ELISA試劑盒測定血清中IL-2和INF-γ分泌水平。ELISA法檢測步驟嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗或F檢驗；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組瘤體質(zhì)量比較 經(jīng)exosomes瘤苗治療后H22細(xì)胞株移植瘤生長明顯受到抑制；腹水來源exosomes組、H22細(xì)胞系來源exosomes組瘤體質(zhì)量高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 三組瘤體質(zhì)量比較（ ±s，g）

表1 三組瘤體質(zhì)量比較（ ±s，g）

組別腹水來源exosomes組H22細(xì)胞系來源exosomes組對照組FP瘤體質(zhì)量1.59±0.25 1.68±0.17 2.89±0.31 377.231 0.000 n666

2.2 三組脾淋巴細(xì)胞增殖活性比較 腹水來源exosomes組、H22細(xì)胞系來源exosomes組SI大于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 三組脾淋巴細(xì)胞增殖活性比較（±s ）

表2 三組脾淋巴細(xì)胞增殖活性比較（±s ）

組別腹水來源exosomes組H22細(xì)胞系來源exosomes組對照組n666 FP SI 4.19±0.31 3.28±0.27 2.29±0.25 258.354 0.000

2.3 三組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較 腹水來源exosomes組、H22細(xì)胞系來源exosomes組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 三組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較（ ±s，mg/g）

表3 三組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較（ ±s，mg/g）

組別腹水來源exosomes組H22細(xì)胞系來源exosomes組對照組n666 FP脾臟指數(shù)11.04±0.39 9.84±0.86 7.28±0.67 192.379 0.000胸腺指數(shù)5.76±0.45 3.31±0.63 1.82±0.30 267.622 0.000

2.4 三組脾淋巴細(xì)胞殺傷活性比較 小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞毒活性隨效靶比的上升而逐漸提高，腹水來源exosomes組、H22細(xì)胞系來源exosomes組20∶1、40∶1和80∶1脾淋巴細(xì)胞殺傷活性大于對照組（P＜0.05），見表4。

表4 三組脾淋巴細(xì)胞殺傷活性比較（ ±s，%）

表4 三組脾淋巴細(xì)胞殺傷活性比較（ ±s，%）

組別腹水來源exosomes組H22細(xì)胞系來源exosomes組對照組n666 20∶1 43.30±2.36 31.20±2.16 40∶1 63.40±3.45 44.20±2.93 40∶1 63.40±3.45 44.20±2.93 FP 4.80±0.37 163.257 0.000 8.70±0.60 182.325 0.000 8.70±0.60 182.325 0.000

2.5 三組血清IL-12、INF-γ水平比較 腹水來源exosomes組、H22細(xì)胞系來源exosomes組IL-2、INF-γ水平高于對照組（P＜0.05），見表5。

表5 三組血清IL-12、INF-γ水平比較（ ±s，pg/ml）

表5 三組血清IL-12、INF-γ水平比較（ ±s，pg/ml）

組別腹水來源exosomes組H22細(xì)胞系來源exosomes組對照組n666 FP IL-12 386.42±35.52 261.19±22.87 131.98±16.28 289.751 0.000 INF-γ 93.48±15.92 72.69±13.27 32.54±10.21 176.852 0.000

3 討論

肝癌致死率較高，尤其在我國每年因肝癌致死的人數(shù)大約占全世界肝癌死亡總數(shù)的51%[9，10]，特別是晚期肝癌預(yù)后極差，且大部分常規(guī)治療方式無效[11]。近年來隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，肝細(xì)胞癌的免疫治療越來越受到關(guān)注，腫瘤疫苗是近年研究的熱點之一[12-14]。腫瘤細(xì)胞來源的exosomes瘤苗是腫瘤細(xì)胞分泌的一種小囊泡，其擁有腫瘤共同抗原，并含有大量的熱休克蛋白（heat-shock proteins，HSP）70～90、MHCI類分子等重要抗腫瘤免疫因子，有望成為一種新的亞細(xì)胞瘤苗[15，16]。本研究分別從肝癌腹水和小鼠肝癌H22細(xì)胞系中分離exosomes瘤苗治療小鼠H22移植瘤，通過比較不同來源exosomes對小鼠免疫功能及H22細(xì)胞皮下移植瘤生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌腹水和小鼠肝癌H22細(xì)胞系中分離exosomes瘤苗均能增強小鼠的免疫功能，產(chǎn)生一定的抗腫瘤活性。

抗腫瘤免疫是一個由各種相互影響的分子構(gòu)成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，通過免疫應(yīng)答反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞或通過分泌IL-2、INF-γ等細(xì)胞因子來增強CTL活性起抑制腫瘤生長的作用[17]。本實驗通過檢測exosomes瘤苗對荷瘤小鼠脾臟和胸腺增殖能力、脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性、脾臟淋巴細(xì)胞對H22細(xì)胞的殺傷活性以及血清中IL-2和INF-γ水平的影響，基本上可以反映出exosomes瘤苗產(chǎn)生的抗腫瘤免疫反應(yīng)。脾是人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要基地，而胸腺是CD4+T淋巴細(xì)胞分化以及發(fā)育的主要基地。本實驗結(jié)果顯示，exosomes瘤苗不但提升了小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)，而且促進(jìn)了脾淋巴細(xì)胞增殖活性及殺傷活性。課題組前期研究已證實[18]，H22細(xì)胞株中分離exosomes瘤苗能通過增強小鼠免疫功能，從而抑制移植瘤的生長，而本研究結(jié)果進(jìn)一步說明腫瘤腹水來源exosomes瘤苗的抗腫瘤免疫效應(yīng)更強。IL-2在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其能促進(jìn)T細(xì)胞增殖并增強其活性、激活LAK細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用、誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖及分泌抗體、激活NK細(xì)胞從而增強抗腫瘤免疫作用[19]；INF-γ通常由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，它激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，起到使實體瘤的生長受抑制的效應(yīng)[20，21]。本研究結(jié)果表明，exosomes瘤苗促進(jìn)血清中IL-2和INF-γ水平增高，且肝癌腹水來源的exosomes瘤苗組小鼠血清中IL-2和INF-γ含量更高，說明肝癌腹水來源的exosomes瘤苗也可以通過增強機體抗腫瘤免疫功能，從而發(fā)揮較強的抗腫瘤效應(yīng)。

綜上所述，不同來源的exosomes在抗腫瘤免疫反應(yīng)中均發(fā)揮了重要作用，腹水來源的exosomes激活機體免疫系統(tǒng)后，能產(chǎn)生更強的抗腫瘤免疫效應(yīng)。眾所周知，腫瘤往往采用的是多種手段的聯(lián)合治療，腫瘤疫苗是未來探索和發(fā)展的方向之一，然而單一腫瘤疫苗本身誘導(dǎo)的免疫作用有限，還需探尋更多更好的分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，來增強exosomes誘導(dǎo)的CTL活性，從而發(fā)揮更強的抗腫瘤效應(yīng)。