高偉城，王小平*，黃建軍，王二麗，謝偉容，黃醒梅，林小晴，陳羽晴

1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.漳州市醫(yī)院，福建 漳州 363000

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉[1]，具有祛痰、止咳、抗炎、抗肺纖維化等功效[2]，臨床應(yīng)用廣泛。以“咳嗽”和“枇杷葉”為關(guān)鍵詞在中國中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫（http://cintmed.cintcm.com/cintmed/）中進(jìn)行檢索，有70 首方劑。其中，三萜酸類成分是其重要藥效成分[3]，主要為熊果酸、齊墩果酸及以其為母體的衍生物[4]。

福建省云霄縣有“中國枇杷之鄉(xiāng)”的稱號，枇杷種植面積達(dá)0.93 萬hm2，而果農(nóng)常把枇杷葉當(dāng)作柴火燒掉或不處理。若能進(jìn)行資源再利用，不僅可以給當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收，也可為云霄區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來新動力[5-6]。

本研究對云霄枇杷葉三萜酸類成分進(jìn)行提取工藝研究，以期對枇杷葉進(jìn)行資源開發(fā)利用，為進(jìn)一步研究開發(fā)枇杷葉相關(guān)產(chǎn)品提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀；TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Mettler-Toledo XSE205DU 型電子分析天平、OHAUS PX224ZH/E 型電子分析天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；FST-Ⅲ-10 型精密超純水機(jī)（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）；XL-10B型中藥粉碎機(jī)（廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；CW-2000A 型超聲-微波協(xié)同萃取反應(yīng)儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）；KQ5200 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZKF040 型真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品熊果酸（批號：MUST-19062710，純度≥98.46%）、齊墩果酸（批號：MUST-19032706，純度≥98.46%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；香草醛、乙酸銨（西隴科學(xué)股份有限公司，分析純）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司，分析純）；乙醇（食用級）。

枇杷葉（早鐘，批號：20201015）采自云霄縣火田鎮(zhèn)，2020 年10 月采收。經(jīng)漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院中藥教研室王小平教授鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 枇杷葉預(yù)處理

將新鮮采收的枇杷葉用沸水潬3 min左右，取出晾干，再用鼓風(fēng)干燥箱70 ℃烘干，備用。

2.2 枇杷葉干浸膏制備

將枇杷葉切成寬絲（9～10 mm），稱取50 g，以適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間、提取次數(shù)進(jìn)行回流提取，濃縮提取液，真空減壓干燥，即得，備用。

2.3 考察指標(biāo)

以干浸膏得率、總?cè)扑岷俊R墩果酸及熊果酸的含量為評價參數(shù)，設(shè)置權(quán)重系數(shù)分別為20%、40%、40%，進(jìn)行無量綱化加權(quán)處理，得綜合評價值。

2.4 總?cè)扑岷繙y定

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸對照品5.22 mg，置于50 mL 量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為104.4 μg·mL-1的對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 稱取干浸膏0.01 g，加甲醇超聲溶解并定容至25 mL，即得，備用。

2.4.3 測定波長的選擇 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1 mL于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴將溶劑蒸干，加入新配制5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，再加入的高氯酸0.8 mL，充分搖勻，在60 ℃的水浴中加熱15 min，立即取出，放入冷水中冷卻至室溫，再加入冰醋酸5 mL，搖勻。在400～800 nm 波長進(jìn)行掃描，以甲醇試劑作參比。結(jié)果表明，供試品溶液和對照品溶液在550 nm 處均有最大吸收，空白干擾最小，故選550 nm作為測定波長。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取熊果酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴加熱蒸干溶劑，依次加入新配制5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，充分搖勻，在60 ℃的水浴中加熱15 min，立即取出，放入冷水中冷卻至室溫，再加入冰醋酸5 mL，搖勻。以0 mL 作空白對照，在550 nm 波長處測定吸光度（A）[7]。以A為縱坐標(biāo)（Y），熊果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=0.050 1X-0.020 4，r=0.999 1，結(jié)果表明，熊果酸在3.48～17.4 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗 準(zhǔn)確吸取熊果酸對照品溶液1 mL，按照2.4.4項下方法連續(xù)測定6次，測得A的RSD為0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗 準(zhǔn)確吸取6份枇杷葉寬絲（9～10 mm）各50 g，按照2.4.2項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1 mL，按照2.4.4 項下方法測定，測得含量的RSD 為1.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 準(zhǔn)確吸取6 份供試品溶液1 mL，于室溫放置0、2、4、8、16、24 h，按照2.4.4 項下方法測定A，測得A的RSD 為1.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率試驗 準(zhǔn)確稱取6 份枇杷葉寬絲（9～10 mm）各25 g，按照2.4.2 項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1 mL 置具塞試管中，再分別加入熊果酸對照品溶液0.5 mL，按照2.4.4 項下方法測定，平均加樣回收率為98.62%，RSD為1.76%。

2.4.9 樣品溶液測定 精密吸取供試品溶液1 mL，按照2.4.4 項下方法進(jìn)行測定，按公式（1）計算總?cè)扑豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)（K）。

式中，C為供試品溶液質(zhì)量濃度，L為稱取干浸膏的質(zhì)量，M為總干浸膏質(zhì)量。

2.5 齊墩果酸和熊果酸的含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack Scepter HDC18-80（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨溶液（67∶12∶21）；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃。色譜圖見圖1。

圖1 枇杷葉供試品溶液與混合對照品溶液的HPLC圖

2.5.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸、齊墩果酸對照品適量，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成熊果酸492.5 μg·mL-1、齊墩果酸125 μg·mL-1的混合對照品儲備溶液，備用。

2.5.3 供試品溶液的制備 稱取干浸膏0.09 g，加甲醇超聲溶解并定容至25 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、2、3、4、5、10 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，分別精密吸取20 μL，按2.5.1 項下色譜條件測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果熊果酸線性回歸方程：Y=668.26X+92.065，r=0.999 6，在0.985～4.925 μg 峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系，齊墩果酸線性回歸方程：Y=722.07X+75.524，r=0.999 5，在0.25～1.25 μg 峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗 精密吸取同一質(zhì)量濃度的混合對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣測定6次，計算熊果酸的峰面積RSD 為1.07%，齊墩果酸的峰面積RSD 為1.01%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同批次枇杷葉（批號：20201015）50 g，按2.5.3項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、8、16、24 h 后分別取樣測定，結(jié)果熊果酸的峰面積RSD 為1.62%，齊墩果酸的峰面積RSD 為1.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗 精密稱取6 份同批次枇杷葉（批號：20201015）50 g，按2.5.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.997（RSD為1.06%）、7.667 mg·g－1（RSD為1.75%）。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取6 份已知含量的枇杷葉25 g，每份分別精密加入123.13 μg·mL-1的熊果酸、31.25 μg·mL-1的齊墩果酸對照品溶液1 mL，按2.5.3 項下方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果熊果酸平均回收率為99.61%，RSD 為1.22%；齊墩果酸平均回收率為99.11%，RSD為1.92%。

2.5.9 樣品含量測定 精密移取2.5.3 項下供試品溶液，按2.5.1 項下色譜條件進(jìn)樣，每個樣品平行測定3 次，采用外標(biāo)法計算樣品中熊果酸、齊墩果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.6 提取方法篩選

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[3,8-9]，本實驗對比了回流提取法、超聲提取法和超聲微波協(xié)同提取法，共同方法為50 g枇杷葉，80%乙醇，液料比10∶1，提取3 次。結(jié)果表明，在不同提取條件下，前2次提取得到的枇杷葉干浸膏得率、總?cè)坪?、齊墩果酸及熊果酸含量可達(dá)到90%以上；超聲提取與超聲微波協(xié)同提取兩者提取效果相當(dāng)，相對來說超聲微波協(xié)同提取更省時，而回流提取效果在3 個方法中最好（表1）。從經(jīng)濟(jì)性、安全性角度，回流提取更符合工業(yè)化生產(chǎn)實際。

表1 枇杷葉提取工藝提取方法的篩選

2.7 單因素試驗

按照表2 的設(shè)計條件每組進(jìn)行回流提取，考察各因素下干浸膏得率、總?cè)扑岷俊R墩果酸和熊果酸含量的變化影響。見圖2。

圖2 枇杷葉提取工藝單因素的試驗結(jié)果

表2 枇杷葉提取工藝單因素試驗設(shè)計

結(jié)果表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提升，干浸膏得率、總?cè)扑岷俊R墩果酸和熊果酸含量有明顯的增加，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～80%時增加顯著，80%～95%時增加稍緩和，這與三萜類成分極性低相符合。當(dāng)液料比為14∶1 時，干浸膏得率、總?cè)坪?、齊墩果酸和熊果酸含量開始有明顯增加。飲片切絲寬度，對干浸膏得率、總?cè)坪?、齊墩果酸和熊果酸含量影響較小。隨著提取時間延長，干浸膏得率、總?cè)坪俊R墩果酸和熊果酸含量有緩慢增加趨勢。

2.8 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗

2.8.1 響應(yīng)面法設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計四因素三水平試驗方案，見表3。選擇中心點重復(fù)試驗5次，得交互作用試驗29 組，以干浸膏得率、總?cè)扑岷?、齊墩果酸及熊果酸的含量進(jìn)行無量綱化處理得到的綜合評價值為考察指標(biāo)，進(jìn)行試驗，結(jié)果見表4。

表3 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗因素水平

表4 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.8.2 模型建立及其顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，得到二次多元回歸方程：Y=0.87-0.026A+0.021B+0.032C+0.065D+0.020AB-0.029AC -0.042AD+0.012BC -4.250×10-3BD+0.019CD+4.792×10-3A2-0.011B2-0.030C2-0.068D2。方差分析結(jié)果見表5，結(jié)果表明，模型的P＜0.001，回歸模型極顯著；失擬項P＞0.05，顯示非試驗因素對試驗結(jié)果影響不大；決定系數(shù)0.921 6＞0.6，模型擬合較高；變異系數(shù)為3.35%，試驗精確度良好；信噪比（S/N）為12.402＞4，表明可用模型對三萜酸的提取進(jìn)行分析和預(yù)測。由回歸模型顯著性分析可知，B 和C2顯著（P＜0.05），A、C 和AD 非常顯著（P＜0.01），D 和D2極顯著（P＜0.001)，其余項均不顯著。4 個因素對三萜酸的提取影響順序為D＞C＞A＞B。

表5 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果

2.8.3 兩兩因素交互作用分析 枇杷葉提取兩兩因素之間交互作用的響應(yīng)面3D圖與等高線圖，見圖3?？梢钥闯?，提取次數(shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)2 個因素的交互影響作用最強(qiáng)，隨著提取次數(shù)增加，綜合評價值明顯升高，且等高線呈橢圓形。其次是提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比與提取次數(shù)影響最小。

圖3 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗各因素交互作用對綜合評價的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.8.4 提取條件的優(yōu)化及模型驗證結(jié)果 由響應(yīng)面法得出的枇杷葉三萜酸的最佳提取工藝條件為95%乙醇，液料比16∶1，提取時間2.31 h，提取數(shù)2.18次，理論綜合評價值為0.881?？紤]實際操作，將最佳工藝條件修正為95%乙醇，液料比16∶1，提取時間2 h，提取數(shù)2 次，在此條件下平行試驗3 次，得枇杷葉干浸膏得率為23.60%，總?cè)扑豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.71%，齊墩果酸與熊果酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.94%［《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定不低于0.7%］，綜合評價值的平均值為0.838（RSD 為2.54%），比模型綜合評價值低0.043，這與實際修正提取時間、提取次數(shù)有關(guān)，因兩者對結(jié)果有顯著影響，表明Design-Expert 8.0.6 建立的模型的預(yù)測具有良好的準(zhǔn)確率，可以很好地優(yōu)化枇杷葉中三萜酸類成分的提取工藝。

3 討論

3.1 提取方法篩選

本實驗比較了回流提取、超聲提取及超聲微波協(xié)同提取，結(jié)果表明，超聲提取和超聲微波協(xié)同提取效果相當(dāng)，超聲微波提取更省時，回流提取效果更好?；亓魈崛》檄h(huán)境友好的理念，操作簡單、經(jīng)濟(jì)安全、大規(guī)?；a(chǎn)投資較少，而且為后續(xù)純化工藝帶來了便捷[8]。

3.2 測定波長、流動相和色譜柱選擇

齊墩果酸與熊果酸兩者是同分異構(gòu)體，分離難，在查文獻(xiàn)、借鑒前人的研究結(jié)果基礎(chǔ)上[3,9-12]，分別對190、208、210 nm 進(jìn)行檢測波長篩選，最終確定210 nm，該波長下齊墩果酸與熊果酸吸收峰峰形較好。分別對乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨溶液、乙腈-水、甲醇-水及乙腈-磷酸水的不同比例進(jìn)行考察，也考察了不同型號的色譜柱如Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），最后選擇Shim-pack Scepter HDC18-80 色譜柱，乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨溶液，可以將兩者較好分離。

3.3 飲片切制寬度

中藥飲片切絲，適用于皮類、葉類和較薄的果皮類等藥材?！吨袊幍洹?020年版（四部）0213炮制通則，飲片切絲，細(xì)絲2～3 mm，寬絲5～10 mm。本實驗考察了細(xì)絲與寬絲對三萜酸的提取率影響，結(jié)果表明，細(xì)絲與寬絲對三萜酸的提取率影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與市場上枇杷葉飲片切制規(guī)格寬絲（9～10 mm）相符合。

3.4 提取條件的優(yōu)化

查閱有關(guān)枇杷葉三萜酸提取工藝的文獻(xiàn)[3,8]，有14.4 倍量82%乙醇，提取2 次，每次155 min，三萜酸提取率為3.38%，本實驗三萜酸提取率為5.71%，獲得較高的三萜酸提取率。但乙醇體積分?jǐn)?shù)高，液料比為16∶1，溶劑用量相對大一些，也相應(yīng)增加工業(yè)生產(chǎn)安全性風(fēng)險及成本。