王楚，屠潤(rùn)妍，費(fèi)霞，田一辰，李權(quán)，2*，石火英，2*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

沙門(mén)菌(Salmonella)屬于腸桿菌科，是一種無(wú)芽孢、無(wú)莢膜革蘭陰性桿菌。廣泛存在于人和動(dòng)物的糞便中，也是食源性疾病最重要的病原體[1]。沙門(mén)菌血清型眾多，根據(jù)脂多糖抗原(O)和鞭毛抗原(H)的差異，可以將沙門(mén)菌分為2 600多種血清型，這些血清型均可引起食物性中毒[2-3]。在所有沙門(mén)菌血清型中，鼠傷寒沙門(mén)菌是最重要的食源性人畜共患病原菌之一[4-5]，其感染發(fā)病率居沙門(mén)菌感染的首位，約占人源沙門(mén)菌感染的40%～80%。人食用了污染鼠傷寒沙門(mén)菌的畜禽產(chǎn)品，可引發(fā)食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、敗血癥和傷寒等臨床疾病。目前還沒(méi)有有效的藥物來(lái)防止鼠傷寒沙門(mén)菌的傳播。顯而易見(jiàn)，鼠傷寒沙門(mén)菌的人群感染潛力已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人類食品安全。因此，加強(qiáng)沙門(mén)菌的致病機(jī)制研究并開(kāi)發(fā)有效的防控策略已刻不容緩。

外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是一種在革蘭陰性菌中普遍存在的包含生物學(xué)活性物質(zhì)的囊泡狀結(jié)構(gòu)，其直徑大小多在20～250 nm之間[6-7]。其組成成分包括脂多糖(LPS)、外膜蛋白、磷脂、DNA以及在形成過(guò)程中被外膜包裹的周質(zhì)成分等。由于OMVs不能復(fù)制且包含大量具有天然構(gòu)象的外膜抗原，其包含的LPS又可作為自身佐劑，能夠有效激活宿主免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，其作為一種新穎的亞單位疫苗可以極大的提升抗原的免疫原性，因此在防控細(xì)菌性疾病中具有極大的潛力。與傳統(tǒng)疫苗相比，OMVs疫苗具有易獲取、免疫原性好、安全性高以及可定向改造等優(yōu)點(diǎn)。但OMVs疫苗也存在產(chǎn)量低這一主要問(wèn)題，作為免疫原，OMVs產(chǎn)量低是誘導(dǎo)高免疫保護(hù)效力和一線生產(chǎn)疫苗的大忌，因此如何提高OMVs的產(chǎn)量仍有待深入研究。

Tol-Pal系統(tǒng)復(fù)合體(包括TolA、TolB、TolQ、TolR和Pal)是一種細(xì)胞分裂成分，它橫跨于革蘭陰性菌的內(nèi)膜、周質(zhì)和外膜，并與肽聚糖相互作用。OMVs主要由菌體的外膜和周質(zhì)成分組成，Tol-Pal系統(tǒng)復(fù)合體是OMVs的關(guān)鍵組成部分。有研究表明，大腸桿菌的Tol-Pal系統(tǒng)在維持細(xì)菌外膜完整性中發(fā)揮重要作用[8]，Tol-Pal系統(tǒng)相關(guān)基因的敲除可降低細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而顯著提高OMVs的產(chǎn)量。這種作用在不同血清型的沙門(mén)菌中的作用似乎不同。例如有研究報(bào)道人傷寒沙門(mén)菌缺失tolR基因后，分泌的OMVs至少提高1 000倍[9]。但是鼠傷寒沙門(mén)菌缺失tolR基因后，其OMVs的產(chǎn)量?jī)H僅提高2倍，提示在不同血清型的沙門(mén)菌中Tol-Pal系統(tǒng)相關(guān)基因?qū)MVs產(chǎn)量的影響有差異[9]。目前為止，Tol-Pal系統(tǒng)相關(guān)基因在鼠傷寒沙門(mén)菌中的作用及其對(duì)OMVs的產(chǎn)量的影響還不是特別清楚。本研究利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建了鼠傷寒沙門(mén)菌tolA基因缺失株ΔtolA，并進(jìn)一評(píng)估了ΔtolA的生長(zhǎng)特性、細(xì)菌形態(tài)、運(yùn)動(dòng)特性、存活能力以及OMVs的產(chǎn)量等生物學(xué)功能，以期探究tolA基因在鼠傷寒沙門(mén)菌中的作用及其對(duì)OMVs的產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

鼠傷寒沙門(mén)菌χ3761、自殺載體質(zhì)粒pRE112、大腸桿菌χ7213由美國(guó)Curtiss Roy教授惠贈(zèng)；鼠傷寒沙門(mén)菌缺失株ΔtolA和自殺載體質(zhì)粒pRE112::CmR-tolA-LR由本試驗(yàn)構(gòu)建；本文中所用到的引物序列如表1所示，由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 本文所用到的引物

1.2 ΔtolA缺失株的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中鼠傷寒沙門(mén)菌χ3761的全基因序列，找到tolA基因及其上下游序列，經(jīng)擴(kuò)增tolA-A和tolA-B獲得目的基因上游同源臂tolA-L(301 bp)，擴(kuò)增tolA-C和tolA-D獲得目的基因下游同源臂tolA-R(322 bp)。然后以tolA-L、tolA-R基因片段為模板進(jìn)行融合PCR，擴(kuò)增缺失了目的基因的tolA-LR片段(623 bp)，隨后將tolA-LR克隆到自殺載體pRE112(pRE112::CmR-tolA-LR)，接著轉(zhuǎn)化至2, 6-二氨基庚二酸(DAP)缺陷菌株χ7213中，酶切和序列鑒定正確后凍存。吸取供體菌χ7213和受體菌χ3761各1滴，混合后接種于LB(含50 mg/mL的DAP)固體培養(yǎng)基上，將結(jié)合菌在含25 μg/mL氯霉素的LB平板上劃線。挑取單菌落于LB液體中培養(yǎng)至云霧狀，隨后涂布于含5%蔗糖的LB平板上，如果細(xì)菌只在普通固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而在氯霉素培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)，此類菌落為疑似成功的基因缺失株，選用tolA外部引物(A/D)進(jìn)行鑒定，篩選ΔtolA缺失株(見(jiàn)圖1)。

圖1 缺失株ΔtolA的構(gòu)建示意圖

1.3 ΔtolA缺失株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將-80 ℃凍存的χ3761和ΔtolA用接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，第2天挑單菌落至LB試管中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.9)，然后按1∶200的比例分別接種到50 mL LB培養(yǎng)基中。在37 ℃恒溫?fù)u床180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，之后每隔1 h測(cè)1次OD600的讀值，記錄并繪制生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 革蘭染色觀察

取一張干凈的玻片，用注射器抽取生理鹽水滴一滴到玻片中央，將接種環(huán)放于酒精燈外焰滅菌，接著挑取菌落，均勻涂抹在生理鹽水上，做成直徑為1 cm的薄層，再將接種環(huán)滅菌放回，最后把玻片置于酒精燈外焰干燥固定。首先在固定過(guò)的涂片菌膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液初染1 min后，用細(xì)小的水流沖洗；然后加碘液媒染1 min，用細(xì)小水流沖洗；接著加95%酒精，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，20～30 s后再進(jìn)行水洗；最后加石炭酸復(fù)紅染色液復(fù)染1 min后進(jìn)行水洗，將玻片自然干燥，鏡檢拍照。

1.5 菌體的透射電鏡觀察

為了檢測(cè)敲除tolA基因是否影響χ3761的表型變化，參考之前報(bào)道進(jìn)行透射電鏡觀察[10]。將χ3761和ΔtolA培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.9)，PBS洗滌2次后，用5%的戊二醛室溫固定2 h，然后再用2%四氧化鋨固定2 h。樣品用不同濃度的丙酮梯度脫水，嵌入環(huán)氧樹(shù)脂中后制作切片，將切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛分別染色，隨后在透射電子顯微鏡上以80 kV的加速電壓進(jìn)行觀察拍照。

1.6 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

將χ3761和ΔtolA培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.9)，PBS洗滌2次后，各吸1 μL滴于含有0.50%瓊脂和0.02%阿拉伯糖的LB平板上，隨后放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，最后取出平板測(cè)量菌圈直徑，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 脫氧膽酸鈉和萬(wàn)古霉素敏感性檢測(cè)

將χ3761和ΔtolA培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.9)，隨后收集菌體，PBS清洗2次后與終濃度0.5%的脫氧膽酸鈉或PBS在37 ℃孵育2 h，然后將細(xì)菌梯度平板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)其存活率差異。沙門(mén)菌存活率表示為(0.5%脫氧膽酸鈉中細(xì)菌CFU/PBS中細(xì)菌CFU)×100%。萬(wàn)古霉素敏感性測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用Kirby-Bauer圓盤(pán)擴(kuò)散技術(shù)[11]，萬(wàn)古霉素片含有30 μg的抗生素。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。通過(guò)測(cè)定缺失株對(duì)脫氧膽酸和萬(wàn)古霉素的抵抗力差異推斷菌株外膜結(jié)構(gòu)的完整性。

1.8 OMVs的提取

挑取χ3761和ΔtolA單菌落分別于5 mL的LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，各取3 mL按1∶100比例擴(kuò)大培養(yǎng)至300 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)，搖菌至OD600=1.0，8 000 r/min，離心30 min，收集上清液，用0.45 μm的細(xì)菌濾器過(guò)濾，接種少量濾液于LB固體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，以檢測(cè)濾液是否徹底無(wú)菌，將無(wú)菌濾液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，30 000 r/min，4 ℃超速離心3 h，棄其上清液，將沉淀重懸于1 mL無(wú)菌PBS中，隨后將粗提的OMVs樣品進(jìn)行密度梯度離心，在離心管中依次加入濃度不連續(xù)的Optiprep (Axis-Shield)梯度分離液(依次為45%，40%，35%，30%，25%，20%)，將OMVs樣品加入液體最上方，30 000 r/min，4 ℃超速離心過(guò)夜。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果將某一濃度下富集的OMVs分離液進(jìn)行再次超速離心，得到的沉淀即為富集的沙門(mén)菌OMVs，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有的OMVs樣品在提取和純化過(guò)程中至少獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 OMVs的透射電鏡觀察

電鏡觀察采用負(fù)染色法，取5 μL OMVs樣品滴在具有膜的銅網(wǎng)上，靜止10 min后濾紙吸去多余懸液，然后滴加2%的磷鎢酸染液于銅網(wǎng)上，靜止5 min后濾紙吸去多余染液，自然半干后透射電鏡觀察OMVs的形態(tài)并拍照記錄結(jié)果。

1.10 OMVs中蛋白濃度的測(cè)定

用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)所提取OMVs中的蛋白濃度，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，用96孔板進(jìn)行檢測(cè)。首先將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.5 mg/mL，作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)液；然后配制適量BCA工作液，充分混勻；隨后將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液配置成合適的濃度，分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL；加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20 μL，需加PBS補(bǔ)足到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20～30 min；冷卻至室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A562的吸光值，記錄數(shù)據(jù)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

1.11 OMVs中脂類含量的檢測(cè)

脂類含量的測(cè)定參考之前報(bào)道的方法[12]。首先取等體積的OMVs樣品與FM4-64分子探針在37 ℃孵育10 min，F(xiàn)M4-64分子探針濃度為3.3 μg/mL，用不添加探針的OMVs樣品和單獨(dú)的FM4-64探針?lè)謩e作為陰性對(duì)照。隨后，我們使用506 nm激發(fā)波長(zhǎng)和750 nm發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行熒光測(cè)量。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

PCR結(jié)果顯示，在623 bp處有特異性陽(yáng)性條帶(見(jiàn)圖2)，與預(yù)期的融合片段大小相符。雙酶切結(jié)果也顯示自殺載體pRE112::CmR-tolA-LR構(gòu)建成功(見(jiàn)圖3)。

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. 陽(yáng)性克隆菌落圖2 重組自殺質(zhì)粒的PCR鑒定

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. 陽(yáng)性克隆菌落圖3 重組自殺質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 ΔtolA缺失株的構(gòu)建與驗(yàn)證

基于同源重組的原理，將χ3761作為受體菌，含有重組自殺質(zhì)粒pRE112::CmR-tolA-LR的χ7213作為供體菌，通過(guò)不斷的篩選和鑒定，對(duì)疑似突變體進(jìn)行了PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示缺失株的同源臂引物tolA-AD擴(kuò)增出來(lái)的片段大小比在親本株中的片段小一個(gè)目的基因長(zhǎng)度，證明缺失株構(gòu)建成功(見(jiàn)圖4)。

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. χ3761；2. ΔtolA圖4 ΔtolA缺失株P(guān)CR鑒定

2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

為了探究缺失tolA是否會(huì)對(duì)χ3761的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，分別檢測(cè)了χ3761與ΔtolA的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，兩株菌的生長(zhǎng)特性沒(méi)有明顯的差異(見(jiàn)圖5)。

數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。下同圖5 χ3761與ΔtolA生長(zhǎng)曲線

2.4 革蘭染色觀察

為了探究缺失tolA是否會(huì)對(duì)χ3761的菌體形態(tài)產(chǎn)生影響，分別對(duì)χ3761與ΔtolA進(jìn)行了革蘭染色并觀察。結(jié)果顯示，χ3761呈革蘭陰性、兩端鈍圓的短桿菌，而突變株ΔtolA形態(tài)發(fā)生明顯改變，如紅色箭頭所指菌體呈球形，散在、成對(duì)或短鏈狀分布(見(jiàn)圖6)。試驗(yàn)結(jié)果提示，缺失tolA后很可能對(duì)χ3761的外膜完整性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖6 χ3761與ΔtolA革蘭染色光學(xué)顯微鏡觀察

2.5 透射電鏡觀察

為了進(jìn)一步探究缺失tolA是否會(huì)對(duì)χ3761的菌體形態(tài)產(chǎn)生影響，隨后對(duì)χ3761與ΔtolA進(jìn)行了透射電鏡觀察。結(jié)果顯示χ3761形態(tài)正常，呈短桿狀。ΔtolA呈多個(gè)相連的橢圓形，菌體周圍有許多OMVs分泌，與野生株相比，ΔtolA缺失株形態(tài)發(fā)生明顯的改變(見(jiàn)圖7)。該試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)缺失tolA后確實(shí)對(duì)χ3761的外膜完整性產(chǎn)生了影響，進(jìn)而影響菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，最終可能影響OMVs的產(chǎn)量。

左側(cè)兩圖為χ3761，右側(cè)兩圖為ΔtolA圖7 χ3761與ΔtolA透射電鏡觀察

2.6 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

對(duì)χ3761與ΔtolA的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，ΔtolA的菌圈直徑大約為6 mm，野生株χ3761的菌圈直徑是缺失株的2.17倍，數(shù)據(jù)表明將tolA基因缺失后，χ3761的運(yùn)動(dòng)能力顯著下降(見(jiàn)圖8)。

A.運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)；B.遷移直徑差異分析**表示差異極顯著(P<0.01)。下同圖8 χ3761與ΔtolA的運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

2.7 脫氧膽酸存活率和萬(wàn)古霉素的敏感性檢測(cè)

為了探究tolA基因是否是影響鼠傷寒沙門(mén)菌外膜的完整性，比較了χ3761和ΔtolA在0.5%的脫氧膽酸鈉中存活率的差異。外膜完整性的受損會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)脫氧膽酸鈉的敏感性增加。結(jié)果顯示，脫氧膽酸鈉中ΔtolA的細(xì)菌計(jì)數(shù)顯著低于野生株，說(shuō)明敲除tolA基因降低了χ3761對(duì)脫氧膽酸鈉的抵抗能力(見(jiàn)圖9A)。與野生株相比，ΔtolA的外膜完整性受到破壞可能是其在脫氧膽酸鈉中存活率下降的主要原因。為進(jìn)一步研究tolA對(duì)外膜完整性的影響，分析了χ3761和ΔtolA對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性。結(jié)果顯示，ΔtolA對(duì)萬(wàn)古霉素完全敏感，χ3761對(duì)萬(wàn)古霉素完全耐藥(見(jiàn)圖9B)。ΔtolA突變體對(duì)脫氧膽酸鈉和萬(wàn)古霉素的敏感性增加，證實(shí)缺失株外膜完整性受到破壞。

***表示差異極顯著(P<0.001)。下同圖9 χ3761與ΔtolA的脫氧膽酸鈉存活率(A)和萬(wàn)古霉素的敏感性(B)檢測(cè)

2.8 OMVs的透射電鏡觀察和OMVs產(chǎn)量測(cè)定

為了進(jìn)一步探究tolA是否影響鼠傷寒沙門(mén)菌OMVs的形成，提取了χ3761與ΔtolA的OMVs并進(jìn)行了透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，χ3761產(chǎn)生的OMVs多為圓形或橢圓形(黃色箭頭)，并且含有大量鞭毛(藍(lán)色箭頭)。ΔtolA產(chǎn)生的OMVs除了圓形和橢圓形外，還有很多不規(guī)則的桿狀結(jié)構(gòu)(紅色箭頭)。與野生株相比，ΔtolA缺失株OMVs形態(tài)發(fā)生了明顯改變(見(jiàn)圖10A)。值得注意的是，與野生株相比缺失株OMVs中鞭毛顯著減少，這可能是ΔtolA運(yùn)動(dòng)性下降的原因。隨后，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)了OMVs的蛋白濃度，從χ3761中提取的OMVs蛋白的平均濃度為0.17 mg/mL，從ΔtolA中提取的OMVs蛋白的平均濃度分別為1.25 mg/mL，缺失株OMVs的蛋白濃度明顯高于野生株(見(jiàn)圖10B)。脂質(zhì)含量測(cè)定與蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果相一致(見(jiàn)圖10C)。ΔtolA中OMVs脂質(zhì)含量與野生株OMVs相比提高了11.4倍。

A. OMVs的透射電鏡觀察；B. OMVs蛋白濃度差異分析；C. OMVs脂質(zhì)含量差異檢測(cè)圖10 χ3761與ΔtolA OMVs的透射電鏡觀察和OMVs產(chǎn)量測(cè)定

3 討論

細(xì)菌感染仍然是導(dǎo)致人類和動(dòng)物死亡的主要原因之一[13]。由于耐藥菌的增加和快速傳播，抗生素治療細(xì)菌性疾病的有效性受到了挑戰(zhàn)。因此，疫苗被認(rèn)為是后抗生素時(shí)代應(yīng)對(duì)細(xì)菌性疾病最直接有效的策略[14]。細(xì)菌性疾病亞單位疫苗由于其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低及安全性高等優(yōu)勢(shì)，成為細(xì)菌疫苗的重要發(fā)展方向。此類疫苗主要由原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)大規(guī)模生產(chǎn)，表達(dá)產(chǎn)物通常無(wú)法進(jìn)行正確的加工和折疊，影響表達(dá)蛋白的構(gòu)象導(dǎo)致免疫原性較差。除了安全性外，評(píng)價(jià)一個(gè)疫苗的另一個(gè)重要指標(biāo)就是其免疫原性。因此如何提高細(xì)菌性疾病亞單位疫苗的免疫原性成為首要解決的問(wèn)題。由于OMVs含有大量的細(xì)菌抗原，并能有效激活宿主免疫系統(tǒng)，其作為一種新穎的亞單位疫苗可以極大的提升抗原的免疫原性，因此在防控細(xì)菌性疾病中具有極大的潛力[15]。與傳統(tǒng)亞單位疫苗相比，OMVs作為疫苗載體存在諸多優(yōu)勢(shì)：首先，免疫原性好。OMVs為典型的納米顆粒結(jié)構(gòu)，有利于進(jìn)入淋巴管并被抗原遞呈細(xì)胞高效攝取，另外OMVs包含大量天然構(gòu)象的外膜抗原，可有效刺激機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)；其次，OMVs可作為有效的天然佐劑：OMVs含有LPS，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答，因此OMVs具有顯著的疫苗開(kāi)發(fā)潛力。

研究發(fā)現(xiàn)Tol-Pal系統(tǒng)相關(guān)基因在維持細(xì)菌外膜完整性中發(fā)揮重要作用，很可能參與OMVs的生物發(fā)生[16-17]。目前關(guān)于tolA基因的相關(guān)研究大多是針對(duì)大腸桿菌屬的病原菌，在其他致病菌中的研究還相對(duì)較少。本文以tolA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，旨在探討其在鼠傷寒沙門(mén)菌中的作用及其對(duì)OMVs產(chǎn)量的影響。

本研究成功構(gòu)了鼠傷寒沙門(mén)菌基因缺失株ΔtolA，通過(guò)對(duì)野生株和缺失株的生長(zhǎng)特性、細(xì)菌形態(tài)、運(yùn)動(dòng)特性、存活能力以及OMVs的產(chǎn)量等生物學(xué)功能進(jìn)行比較，解析tolA基因在鼠傷寒沙門(mén)菌中的作用。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，野生株χ3761的OMVs樣品中可以看到大量鞭毛，而ΔtolA缺失株OMVs中沒(méi)有明顯的鞭毛。缺失株鞭毛的減少可能是ΔtolA運(yùn)動(dòng)能力下降的重要原因。此外，本研究tolA基因的敲除改變了沙門(mén)菌的細(xì)胞形態(tài)，菌體呈鏈狀、球形且表面有囊泡。在S.Typhi[18]和Erwiniachrysanthem[16]的tol-pal突變體中也可以觀察到類似的表型。造成這種現(xiàn)象的主要原因是菌體的外膜完整性受到了破壞[19]。人們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，Tol-Pal系統(tǒng)介導(dǎo)的磷脂酰甘油運(yùn)輸機(jī)制可能會(huì)影響細(xì)菌外膜的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而改變細(xì)胞形態(tài)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，tolA基因的缺失顯著降低了鼠傷寒沙門(mén)菌在脫氧膽酸鈉中的存活率，并表現(xiàn)出對(duì)萬(wàn)古霉素的高度敏感性。有文獻(xiàn)報(bào)道革蘭陰性菌對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性的增加是由于其外膜受到破壞而通透性增加所導(dǎo)致[21]。這些數(shù)據(jù)表明，tolA突變體的外膜完整性受到破壞。

有文獻(xiàn)報(bào)道,OMVs組分中蛋白質(zhì)和脂肪的含量與OMV產(chǎn)量正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果證實(shí)，將tolA基因缺失后，χ3761的OMVs產(chǎn)量顯著增加。由于鼠傷寒沙門(mén)菌tolA突變體外膜完整性受到破壞且其表面出現(xiàn)明顯的囊泡，推測(cè)tolA基因可能參與OMVs的生物發(fā)生過(guò)程。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)菌ΔtolA缺失株的OMVs產(chǎn)量顯著高于野生株，證實(shí)TolA是OMVs生物發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)菌tolA基因的缺失嚴(yán)重抑制了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，破壞了細(xì)胞的形態(tài)，破壞了外膜的完整性。此外，tolA基因也參與了OMVs的生物發(fā)生。這些研究結(jié)果為T(mén)ol-Pal系統(tǒng)相關(guān)基因的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為之后鼠傷寒沙門(mén)菌OMVs的疫苗開(kāi)發(fā)提供理論參考。