李偉杰，田野，豈曉鑫，蔣桃珍

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞白痢沙門(mén)菌(Salmonellapullorum)具有高度適應(yīng)專(zhuān)一宿主的特點(diǎn)，可引起雞白痢，雛雞多呈急性敗血癥經(jīng)過(guò)，成年雞多呈慢性或隱性經(jīng)過(guò)，可水平傳播，亦可經(jīng)卵垂直傳播，是對(duì)雞群危害最嚴(yán)重的病原細(xì)菌之一[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將雞白痢列為通報(bào)疫病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。目前在我國(guó)，養(yǎng)雞業(yè)存在多種養(yǎng)殖模式，其飼養(yǎng)環(huán)境、生物安全管理水平參差不齊，雞白痢依然發(fā)生和流行[2-3]。疫苗接種被認(rèn)為是降低雞群感染和防控疾病的有效措施之一，但目前還沒(méi)有針對(duì)雞白痢的商品化疫苗[4]，生產(chǎn)中多用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療，但抗生素的長(zhǎng)期使用甚至是不合理使用，已使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致動(dòng)物成為耐藥菌的重要貯存庫(kù)[5]。

沙門(mén)菌的分型方法包括血清學(xué)分型、藥物敏感試驗(yàn)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)等，這些方法在確定與追蹤沙門(mén)菌的感染及溯源方面起著重要的作用[6]。血清分型是監(jiān)測(cè)動(dòng)物中沙門(mén)菌存在與流行的有效工具，細(xì)菌的耐藥特征在流行病學(xué)研究中同樣有重要意義，多位點(diǎn)序列分型是一種基于細(xì)菌看家基因序列的分型方法，在對(duì)病原體流行病學(xué)溯源與監(jiān)控中起重要作用。

本文采用沙門(mén)屬特異性PCR、血清學(xué)試驗(yàn)、雞白痢沙門(mén)菌/雞傷寒沙門(mén)菌鑒別PCR、MLST等方法和藥敏試驗(yàn)分析揚(yáng)州江都區(qū)雞白痢沙門(mén)菌的流行和耐藥情況，為合理用藥提供指導(dǎo)，也為雞白痢的綜合防控和凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

樣品為2018至2019年從揚(yáng)州江都區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)疑似患雞白痢的病死雞體內(nèi)分離的59株沙門(mén)菌，PCR陽(yáng)性對(duì)照菌株雞白痢沙門(mén)菌CVCC 79201和雞傷寒沙門(mén)菌CVCC 3759，藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922和ATCC 35218，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所收集保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

胰大豆蛋白胨瓊脂(TSA)購(gòu)自O(shè)XOID公司；沙門(mén)菌O多價(jià)和單價(jià)血清購(gòu)自丹麥國(guó)家血清研究院；10×ExPCR Buffer、dNTP、ExTaq酶、瓊脂糖購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；染料Goldview購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；革蘭陰性需氧菌藥敏板購(gòu)自天津金章科技發(fā)展有限公司。

1.3 引物

參考文獻(xiàn)[7-8]，針對(duì)基因invA(編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白)、glgC(編碼葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶)和speC(編碼鳥(niǎo)氨酸脫羧酶)，由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成引物，具體見(jiàn)表1。沙門(mén)菌的MLST分型中7個(gè)看家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA引物參照http：mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica，具體見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.4 沙門(mén)菌屬PCR鑒定

選擇沙門(mén)菌屬侵襲性抗原保守基因invA序列設(shè)計(jì)的1對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增目的片段大小為284 bp，DNA的提取采用熱裂解法.

PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×ExPCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，模板DNA 2 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。

PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.5 血清型鑒定

采用玻片凝集法，將復(fù)蘇的沙門(mén)菌在TSA平板中進(jìn)行傳代，用一次性接種環(huán)蘸取適量菌苔與O多價(jià)血清充分混勻，來(lái)回傾斜晃動(dòng)載玻片10 s，觀察凝集現(xiàn)象，若凝集則說(shuō)明具有對(duì)應(yīng)的O多價(jià)抗原；挑取單菌落在SWARM瓊脂中央點(diǎn)一點(diǎn)，37 ℃正向培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)定H抗原的操作同O抗原，出現(xiàn)凝集反應(yīng)即為陽(yáng)性；以生理鹽水作為陰性對(duì)照，檢查菌株自身有無(wú)自凝現(xiàn)象。最后查閱White-Kauffmann抗原表[9]確定沙門(mén)菌的血清型。

1.6 glgC和speC雙重PCR

采用glgC和speC雙重PCR鑒別雞白痢沙門(mén)菌。DNA的提取采用熱裂解法。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×ExPCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，模板DNA 2 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.7 多位點(diǎn)序列分型

DNA的提取采用熱裂解法。對(duì)沙門(mén)菌的7個(gè)看家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×ExPCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min?？醇一驍U(kuò)增產(chǎn)物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成測(cè)序，序列測(cè)序結(jié)果上傳http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica進(jìn)行分析，基于等位基因位點(diǎn)的組合而獲得目標(biāo)菌株的序列型(sequence type，ST)。利用https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_salmonella_seqdef中的BURST程序進(jìn)行ST型克隆群(clonal complexes，CC)歸類(lèi)。

1.8 藥敏試驗(yàn)

操作方法參照文獻(xiàn)[10]，利用微量肉湯稀釋法對(duì)12種抗菌藥物進(jìn)行耐藥性分析。將臨床分離的59株雞白痢沙門(mén)菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，挑取2～3個(gè)單菌落置5 mL滅菌生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整濁度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，使含菌量約為1.5×108CFU/mL；取上述菌液60 μL，加入12 mL的藥敏接種培養(yǎng)液中，進(jìn)行混勻稀釋?zhuān)冒说酪埔浩骷尤?6孔革蘭陰性需氧菌藥敏板中。每孔100 μL，將板條放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍的前提下，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷被檢菌株的敏感性并進(jìn)行耐藥性結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門(mén)菌的鑒定

對(duì)59株臨床分離的沙門(mén)菌進(jìn)行屬特異性PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出大小284 bp左右的單一目的條帶，與預(yù)期的片段大小一致，陽(yáng)性對(duì)照成立，空白對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增條帶，部分臨床分離株的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，表明分離菌株均為沙門(mén)菌。

M. DL 2000 DNA Marker; 1～9. 臨床分離株；10.空白對(duì)照；11～12.陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D1 部分沙門(mén)菌菌株invA基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 血清型鑒定結(jié)果

用玻板凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定，59株臨床分離菌株與O9和O12因子血清均呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與H-a、H-d、H-g.m、H-g. p因子血清均呈陰性反應(yīng)，血清抗原式為(9, 12:-:-)。

2.3 雙重PCR鑒別

59株確定為沙門(mén)菌菌株經(jīng)雙重PCR后電泳檢測(cè)，僅擴(kuò)增出252 bp的片段(speC基因)，根據(jù)雞白痢沙門(mén)菌PCR鑒定判定標(biāo)準(zhǔn)，59株為雞白痢沙門(mén)菌。臨床分離株部分電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

M． DL 2000 DNA Marker;1～9. 雞白痢沙門(mén)菌臨床分離株；10.雞白痢沙門(mén)菌CVCC 79201；11.雞傷寒沙門(mén)菌CVCC 3759；12.空白對(duì)照?qǐng)D2 雞白痢沙門(mén)菌鑒別PCR

2.4 多位點(diǎn)序列分型

利用特異性引物對(duì)雞白痢沙門(mén)菌臨床分離株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，得到7個(gè)看家基因的序列后上傳沙門(mén)菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到10個(gè)等位基因，不同的等位基因組合后，共獲得4種ST型，即ST 92、ST 2151、ST 3721和ST 3722，其中ST 92為優(yōu)勢(shì)基因型，具體見(jiàn)表2。利用BURST程序分析，4個(gè)ST型同屬于CC 2151。

表2 雞白痢沙門(mén)菌MLST鑒定

2.5 耐藥性分析

將59株雞白痢沙門(mén)菌進(jìn)行了12種抗菌藥物的敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示：雞白痢沙門(mén)菌對(duì)磺胺異惡唑(SF)的耐藥率最高，對(duì)氨芐西林(AMP)、頭孢噻呋(CEF)、黏菌(CL)素的耐藥性次之，對(duì)其他8種抗菌藥物無(wú)耐藥性，具體見(jiàn)表3。6株菌存在多重耐藥，其中5株為ST 92，1株為ST 3721。59株菌對(duì)12種藥物的耐藥結(jié)果形成4種耐藥譜型，分別為SF、AMP-CL、AMP-CEF、AMP-CEF-SF。

表3 雞白痢沙門(mén)菌藥敏試驗(yàn)

3 討論

雞白痢沙門(mén)菌和雞傷寒沙門(mén)菌同屬于沙門(mén)菌血清D1群，血清抗原式均為(1, 9, 12:-:-)，為同一血清型的不同生物型，因此血清學(xué)方法不能區(qū)分兩者[11]。傳統(tǒng)的區(qū)別方法是基于生化試驗(yàn)，主要包括葡萄糖(產(chǎn)氣)、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等[12]，但一些臨床分離株具有非典型的生化特性[13]?；贒NA的分子技術(shù)有限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和等位基因特異性PCR方法等[14-17]，這些方法都針對(duì)單核苷酸多態(tài)性，只有單個(gè)核苷酸的變異，常規(guī)PCR后需進(jìn)行后續(xù)操作或需要二次PCR。因?yàn)檫@些固有的局限性，在臨床診斷方面較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的沙門(mén)菌全基因組序列完成測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在糖原合成基因位點(diǎn)和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶合成基因位點(diǎn)，雞傷寒沙門(mén)菌、雞白痢沙門(mén)菌與其他D群腸道沙門(mén)菌之間存在差異，據(jù)此設(shè)計(jì)合成引物可以用來(lái)區(qū)分兩者[8, 18]，本研究利用glgC和speC基因特異性引物能夠有效的區(qū)分59株臨床分離的沙門(mén)菌。

沙門(mén)菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，根據(jù)菌體抗原(O抗原)、鞭毛抗原(H抗原)以及Vi抗原的不同，按照Kauffman-White抗原表，截止到2014年共報(bào)道了2 659種血清型[19]。依據(jù)7個(gè)看家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA的多位點(diǎn)序列分型，截止到2021年1月22日，將沙門(mén)菌分為8 354個(gè)ST型。多位點(diǎn)序列分型作為一種常用的適合流行病學(xué)調(diào)查研究的方法，比血清分型具有更強(qiáng)的分型能力，可以更確切地進(jìn)行種群的結(jié)構(gòu)以及生物進(jìn)化方面的研究。本研究中的59株雞白痢沙門(mén)菌分為4種ST型，經(jīng)BURST程序分析，構(gòu)成以ST 2151為中心的克隆群，說(shuō)明從揚(yáng)州江都區(qū)分離的臨床分離株具有很高的親緣關(guān)系。

近年來(lái)，隨著養(yǎng)禽業(yè)向規(guī)模化和集約化方向發(fā)展，細(xì)菌性疾病的混合感染導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性呈上升趨勢(shì)；雞白痢的發(fā)病季節(jié)越來(lái)越不明顯，特別是一些飼料添加劑中盲目使用某些抗菌藥物，導(dǎo)致沙門(mén)菌的耐藥譜有很大的差異[20]。細(xì)菌的耐藥程度也與養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥習(xí)慣密切相關(guān)，用藥不當(dāng)，不僅達(dá)不到治療效果，反而容易引起體內(nèi)正常菌群失調(diào)。在臨床用藥預(yù)防和治療時(shí)，應(yīng)選擇平時(shí)少用或沒(méi)有用過(guò)的藥物，有條件的應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用敏感藥物。在做好藥物選擇的同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，采取聯(lián)合用藥，輪換使用不同的抗生素進(jìn)行定期預(yù)防，亦可采用微生態(tài)制劑來(lái)預(yù)防雞白痢[21]。建議養(yǎng)殖場(chǎng)結(jié)合本場(chǎng)的條件采用多種方法進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)，淘汰疑似陽(yáng)性病雞，從而做到逐步凈化雞群，達(dá)到經(jīng)濟(jì)效益的最大化。