王瑩，李鋒濤，黃美子，陳毓，盧軍鋒，楊雨欣，錢建中

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物藥學院，江蘇 泰州 225300)

黃精為百合科黃精屬植物，其干燥根莖為臨床常用大宗中藥材，具有補氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎的功效。黃精是傳統(tǒng)的藥食同源類中藥，現(xiàn)代研究表明，黃精除用于治療脾胃虛弱、干咳少痰、精血不足等癥，還具有降血壓、防止動脈粥樣硬化、延緩衰老等作用[1-2]。黃精的主要成分有多糖、生物堿、氨基酸等。黃精多糖作為黃精的主要活性成分之一，具有增強免疫功能、抑菌抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂等藥理作用。目前，國內(nèi)對黃精多糖的研究主要集中在降血糖藥物和畜禽免疫增強劑方面[3-5]。Xie等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用，降糖效果好。趙謹?shù)萚6]研究表明，黃精多糖能通過提高雛雞的抗氧化能力，提高血清中免疫球蛋白含量，提高胸腺、法氏囊和脾臟的免疫功能等途徑來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，維持機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。

近年來，國內(nèi)多采用水提醇沉法[7]、微波輔助法[8]、超聲波輔助法[9]、酶輔助提取法[10]等提取多糖。且已有學者研究了黃精多糖的提取工藝，但普遍存在著多糖得率較低的問題[11]。李志濤等[8]采用微波輔助法提取黃精多糖，通過單因素試驗對影響黃精多糖得率的物料粒度、料液比、微波輻照功率、輻照時間進行探討，確定最佳工藝參數(shù)下黃精多糖的得率僅為10.57%；林志鑾等[9]采用超聲波輔助法提取粗多糖，黃精多糖含量為108.57 mg/g；張梓原等[12]比較了水提醇沉法和復合酶法兩種不同提取工藝對黃精多糖得率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，復合酶法得到的多糖得率遠高于水提醇沉法的多糖得率。為了進一步提高黃精多糖得率，本文擬采用超聲輔助復合酶法提取黃精多糖，考察液料比、加酶量、超聲功率以及酶解pH值對黃精多糖得率的影響，通過響應曲面法優(yōu)化其工藝參數(shù)；同時研究黃精多糖的體外抗氧化活性，為黃精多糖的開發(fā)和利用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃精，購自安徽亳州千草藥業(yè)有限公司，60 ℃下真空干燥，經(jīng)多功能粉碎機粉碎，過80目篩，所得黃精粉末密封貯藏，備用；葡萄糖對照品購自中國食品藥品檢定研究院；維生素C(VC)購自上海生工生物工程有限公司，纖維素酶(1.1×105U/g)購自和氏璧生物科技有限公司；果膠酶(5×104U/g)購自和氏璧生物科技有限公司；其余均為市售分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 葡萄糖標準曲線繪制

以無水葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸顯色法測定多糖濃度，以吸光度(y)為縱坐標，葡萄糖濃度(x)為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線[7]。

1.3 黃精多糖的提取及測定

稱取10 g黃精粉末于500 mL具塞錐形瓶中，按照一定的液料比加入一定pH值的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液，混勻，加入適量的纖維素酶與果膠酶，50 ℃酶解，放入超聲清洗器中以一定的功率處理30 min，熱水浸提，抽濾，收集濾液，旋轉(zhuǎn)濃縮，加入足量乙醇溶液，4 ℃醇沉過夜，4 000 r/min離心15 min得沉淀，干燥后即得黃精粗多糖樣品。

將黃精粗多糖用蒸餾水溶解，定容至250 mL，精密量取1 mL 黃精多糖溶液于250 mL 容量瓶中，加入5%苯酚水溶液1 mL、搖勻后加入5 mL濃硫酸，定容，搖勻，靜置30 min，在490 nm 處測定吸光度，根據(jù)下列公式計算黃精多糖得率。

式中：m為黃精粉末的質(zhì)量(mg)；A490為稀釋后的多糖溶液的吸光度；前一個250為稀釋倍數(shù)；后一個250為黃精多糖溶液體積(mL)。

1.4 單因素試驗

在酶添加量1.5%(m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1)，超聲功率320 W，酶解pH值 5.0條件下，考察不同液料比(mL/g)5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1對黃精多糖得率的影響；在液料比20∶1，超聲功率320 W，酶解pH值5.0條件下，考察酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對黃精多糖得率的影響；在酶添加量1.5%(m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1)，液料比20∶1，酶解pH值 5.0條件下，考察超聲功率(240、280、320、360、400 W)對黃精多糖得率的影響；在酶添加量1.5%(m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1)，液料比20∶1，超聲功率320 W條件下，考察酶解pH值(3、4、5、6、7)對黃精多糖得率的影響。以上每個試驗均平行測定3次。

1.5 響應面優(yōu)化黃精多糖提取工藝

根據(jù)單因素分析結(jié)果，以液料比(A)、加酶量(B)、超聲功率(C)、酶解pH值(D)為自變量，以黃精多糖得率為響應值(Y)，采用Box-benhnken試驗設計法進一步優(yōu)化黃精多糖提取工藝。分析因素及水平編碼表見表1。

表1 響應面試驗分析因素與水平

1.6 黃精多糖抗氧化作用試驗

1.6.1 DPPH自由基清除能力測定

參照Shimada等[13]的方法并進行適當改進，配制 0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mg/mL 黃精多糖水溶液，準確移取0.20 mL 不同濃度的黃精多糖水溶液于比色管中，加入預先配置好0.15 mmol/L DPPH 甲醇溶2 mL液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測定其上清液515 nm波長處吸光度 A，同時測定樣品溶液在 515 nm 處的吸光度 A0及 DPPH 甲醇溶液在 515 nm 處的吸光度A1[7]，VC作為陽性對照，平行測定3次，求平均值。按下式計算黃精多糖DPPH自由基清除率。

1.6.2 超氧自由基清除率測定

參照龔霞等[14]的方法并進行適當改進，配制0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mg/mL黃精多糖水溶液，準確移取0.20 mL 不同濃度的黃精多糖提取液于比色管中，加入4 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH值 8.2)和4 mL 20 mmol/L的鄰苯三酚溶液，搖勻后，25 ℃水浴反應10 min，加入1% HCl溶液4 mL，于325 nm處測定吸光度(Ax)，以相同體積蒸餾水作為空白對照，測定空白對照組吸光度A0，VC作為陽性對照，平行測定3次，求平均值。按下式計算黃精多糖超氧自由基清除率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 10.0.3、Excel 2016等軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線繪制

根據(jù)試驗結(jié)果進行線性回歸，得葡萄糖標準曲線：y=0.014 2x-0.006 9，R2=0.996 5，表明在10.56～52.80 μg/mL濃度范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與其吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗

液料比：由圖1A可知，隨著液料比的增加，多糖得率先升高再降低，當液料比為20∶1時，多糖得率最高，故選擇15∶1、20∶1和25∶1進行響應面試驗。

加酶量：由圖1B可知，隨著加酶量的增多，多糖得率逐步提高，后趨于穩(wěn)定，當加酶量超過1.5%后，多糖得率變化不大。故選擇1.0%、1.5%和2.0%進行響應面試驗。

超聲功率：由圖1C可知，隨著超聲功率的增加，黃精多糖得率逐步提高，當超聲功率大于360 W時，黃精多糖得率幾乎不變。故選擇320 、360和400 W進行響應面試驗。

酶解pH值：由圖1D可知，隨著酶解pH的增加，多糖得率先增大后減小，當酶解pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)，黃精多糖得率較高。故選擇4.0、5.0和6.0水平進行響應面試驗。

A. 液料比(mL/g)；B. 加酶量；C. 超聲功率；D. 酶解pH值圖1 各因素對黃精多糖得率的影響

2.3 響應曲面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 黃精多糖得率的數(shù)學模型建立

根據(jù)單因素分析結(jié)果，以液料比(A)、加酶量(B)、超聲功率(C)、酶解pH值(D)為自變量，以黃精多糖得率為響應值(Y)，采用Box-Benhnken試驗設計法進行4因素3水平的響應面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計與結(jié)果

通過Design-Expert 10.0.3軟件將模型進行分析，擬合得到影響黃精多糖得率的回歸方程： 得率Y=27.67+0.46A+0.75B+0.34C+0.55D+0.13AB-0.29AC-0.095AD+0.14BC-0.26BD-0.058CD-0.85A2-3.37B2-2.36C2-4.07D2。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 黃精多糖得率的響應面分析

響應面的陡峭程度反映了不同因素對黃精多糖得率的影響程度，響應面越陡，說明該因素對結(jié)果的影響越大[15]。圖2A～圖2F表示各影響因素兩兩作用對黃精多糖得率的交互影響，其中加酶量對黃精多糖得率影響最大，表現(xiàn)為響應曲面最陡，之后影響因素依次為酶解pH值、液料比、超聲功率，與上述方差分析結(jié)果一致。

A. 超聲功率360 W，酶解pH值5.0；B. 加酶量1.5%，酶解pH值5.0；C. 加酶量1.5%，超聲功率360 W；D. 液料比20∶1，酶解pH值5.0；E. 液料比20∶1，超聲功率360 W；F. 液料比20∶1，加酶量1.5%圖2 各因素交互影響多糖得率的曲面圖

2.3.3 模型驗證

通過建立的模型預測黃精多糖最佳提取工藝為：液料比為21.322∶1(mL/g)，加酶量1.558%，超聲功率362.32 W，酶解pH值5.061，其得率為27.81%，考慮試驗操作的可控性，對上述最優(yōu)提取工藝進行修正：液料比為21∶1(mL/g)，加酶量1.6%，超聲功率360 W，酶解pH值5.0。在此條件下進行驗證試驗，平行測定3次，黃精多糖平均得率為27.02%，與預測值27.81%較為接近，表明該模型能夠預測黃精多糖的提取工藝，模型可靠。

2.4 黃精多糖抗氧化作用分析

2.4.1 清除DPPH自由基能力

由圖3可知，VC對DPPH的清除能力遠遠大于黃精多糖。黃精多糖的清除能力與其濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即隨著黃精多糖濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐漸增強，且趨于平緩，當黃精多糖濃度達到2.00 mg/mL時，黃精多糖對DPPH的清除能力達到78.56%。對試驗結(jié)果進行線性擬合得出方程：Y=35.571X+11.619，R2=0.967 6，根據(jù)方程計算出黃精多糖對DPPH半清除率IC50為1.08 mg/mL。

圖3 黃精多糖和VC對DPPH自由基的清除作用

2.4.2 清除超氧自由基能力

黃精多糖和VC對超氧自由基的清除作用如圖4所示，在0.40～2.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)，黃精多糖對超氧自由基有一定的清除能力，且隨著濃度的增加而增強，清除率由34.25%增加至74.78%，而同濃度的VC對超氧自由基的保持較高的清除率，由88.25%增加至94.38%，且趨于平緩。對試驗結(jié)果進行線性擬合得出方程：Y=27.089X+24.924，R2=0.951 7，根據(jù)方程計算出黃精多糖對超氧自由基半清除率IC50為0.93 mg/mL。

圖4 黃精多糖和VC對的清除作用

3 討論

水提醇沉法是多糖傳統(tǒng)的提取方法，但提取效率較低，耗時較長，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。近年來，隨著生物科技的迅猛發(fā)展，新的多糖提取方法也逐步完善。酶解輔助提取法具有反應條件溫和，提取效率高等優(yōu)點，該法常用的酶主要有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶以及相關(guān)復合酶等；超聲提取法能夠縮短提取時間，加速多糖的溶出速度，但超聲時間不宜過長，否則會引起多糖的降解，影響多糖得率。為了提高黃精多糖的得率，本試驗利用超聲輔助復合酶法提取黃精多糖，針對影響黃精多糖得率的液料比、加酶量、超聲功率和酶解pH值4個因素進行單因素試驗，采用響應曲面法確定最佳工藝參數(shù)為：10 g黃精粉末，液料比為21∶1(mL/g)，加酶量1.6%，超聲功率360 W，酶解pH值5.0，黃精多糖得率可達27.02%，是普通水提法的3.75倍[16]，與苑璐等[10]采用纖維素酶和木瓜蛋白酶提取黃精多糖相比，多糖得率提高了6.47%，這可能是由于超聲輔助提取黃精多糖，更有利于加快多糖的溶出速度，在一定程度上提高黃精多糖的得率；與巫永華[17]采用超聲微波協(xié)同單一酶法提取黃精多糖相比，多糖得率提高了9.59%，這可能是由于不同酶的作用位點不同，選擇合適的復合酶，較單一的酶，更有利于多糖的溶出。目前，低共熔溶劑法被廣泛應用于多糖提取，該法具有性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉、綠色環(huán)保等優(yōu)點，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，汪濤等[18]采用尿素-氯化膽堿低共熔溶劑提取黃精多糖，采用響應面法確定最佳工藝參數(shù)，在此條件下黃精多糖得率為18.55%，但較本試驗黃精多糖得率低8.47%。

在響應曲面法優(yōu)化黃精多糖工藝中，加酶量對多糖得率影響最大，這可能是由于加入的纖維素酶和果膠酶越多，酶與多糖的結(jié)合點越多，加速細胞壁溶解，有利于多糖的溶出[19]；之后影響因素依次是酶解pH值、液料比和超聲功率， pH 值過高或過低，均會降低酶的活性，細胞破壁程度降低，影響胞內(nèi)多糖的滲出[20]；液料比越大，黃精細胞內(nèi)外多糖濃度差越大，傳質(zhì)推動力越大，黃精多糖就越容易浸出[7]，但當料液比過高時，減少了樣品與酶的接觸，影響了多糖得率；超聲功率越大，超聲產(chǎn)生的“空化效應”破壞細胞壁，降低傳質(zhì)阻力，提高多糖的溶出速度[21]，但當功率過大時，可能會導致溫度升高，影響酶的活性。然而在復合酶法提取多糖的過程中，由于不同水解酶的pH值和溫度不一樣，故復合酶中水解酶的選擇和用量配比還需進一步研究。

黃精多糖對DPPH自由基和超氧自由基的半清除率(IC50)分別為1.08 mg/mL、0.93 mg/mL，且其對DPPH自由基和超氧自由基清除率隨著濃度增加而增強，表現(xiàn)出良好的劑量效應關(guān)系，當黃精多糖濃度達到2.00 mg/mL時，其清除率達到78.56%和74.78%。綜上所述，黃精多糖具有良好的抗氧化活性，后續(xù)試驗將對黃精多糖的結(jié)構(gòu)和功效進行探究，有助于加快黃精多糖制劑的開發(fā)，為研制新獸藥奠定基礎。