楊炳雪，白玥，趙玉芬，娜美爾格，蘇布登格日勒*，李海軍*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

在哺乳動(dòng)物中，卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量是保證其持續(xù)發(fā)育能力的必要前提。卵母細(xì)胞質(zhì)量在動(dòng)物體外生產(chǎn)中非常重要[1]，其中體外模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。人們普遍認(rèn)為，造成體外成熟(IVM)效率相對(duì)較低的部分原因，在于體外卵母細(xì)胞的核質(zhì)不同步成熟[2]。眾所周知，第二信使cAMP在維持哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯中起著重要作用[3]。卵母細(xì)胞內(nèi)高濃度的cAMP，可以維持卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，且其受磷酸二酯酶(PDE)和腺苷酸環(huán)化酶(AC)的調(diào)控，分別參與cAMP的降解和合成。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中調(diào)節(jié)cAMP，可能是解決IVM的卵母細(xì)胞與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞之間發(fā)育能力差異的一種方法[4]。通過(guò)在IVM過(guò)程中，使用PDE抑制劑西洛酰胺來(lái)防止卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)中cAMP濃度降低[5]。

促性腺激素誘導(dǎo)cAMP水平的增加與卵泡中類(lèi)固醇激素的增加有關(guān)[6]。動(dòng)物體內(nèi)雌激素的活性以17β-雌二醇(E2)最高，具有廣泛的生理功能。長(zhǎng)期以來(lái)，睪酮和E2一直被認(rèn)為在卵母細(xì)胞的自發(fā)減數(shù)分裂恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用[7]。然而，在大鼠卵泡中發(fā)現(xiàn)，E2可誘導(dǎo)減數(shù)分裂激酶的活性，從而為有絲分裂調(diào)控卵泡發(fā)育提供了證據(jù)[8]。Soares等[9]研究也表明，E2與不同的因子聯(lián)合添加到卵母細(xì)胞IVM體系中，可以維持卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，顯著增加生發(fā)泡(GV)期卵母細(xì)胞的比例。因此，推測(cè)E2可能參與維持卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂停滯作用。

為了提高體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞的發(fā)育能力和質(zhì)量，研究人員提出了雙相體外成熟系統(tǒng)，在成熟前對(duì)cAMP進(jìn)行調(diào)節(jié)，即在IVM前期添加PDE抑制劑與/或AC激動(dòng)劑[10]。相對(duì)于常規(guī)IVM，雙相IVM系統(tǒng)使卵母細(xì)胞發(fā)育能力得到改善[11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠[12]、山羊[13]、綿羊[14]、人[15]等的卵母細(xì)胞在雙相IVM系統(tǒng)的培養(yǎng)下，發(fā)育潛能均有提高。故此，在體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)中探討與應(yīng)用高效cAMP促進(jìn)劑已成為研究熱點(diǎn)。本研究首先在常規(guī)體外成熟培養(yǎng)體系中，測(cè)定了PDE3的抑制劑西洛酰胺的作用效果，隨后在雙相體外成熟系統(tǒng)添加高低濃度E2和/或西洛酰胺，探討其對(duì)綿羊COCs內(nèi)cAMP水平以及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TCM-199(tissue culture medium-199)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自Gibco公司；雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)和卵泡雌激素(FSH)購(gòu)自寧波第二激素廠；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、PBS、DAPI染色液、石蠟油、BSA、透明質(zhì)酸酶和凡士林均購(gòu)自Sigma公司；ELISA試劑盒購(gòu)自Cayman公司；西洛酰胺購(gòu)自Med Chem Express公司。

1.2 綿羊COCs采集

在呼和浩特市某屠宰場(chǎng)，采集選取約6～8月齡的小尾寒羊卵巢，置于30～35 ℃的生理鹽水中，于3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，采用剖割法劃取卵巢表面2～6 mm的卵泡獲取綿羊COCs，并在立式顯微鏡下，選取3層以上致密的卵丘細(xì)胞層及卵胞質(zhì)均勻的COCs，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。

1.3 綿羊COCs的體外成熟培養(yǎng)

在四孔板中分別加入或不加入10 μmol/L 西洛酰胺的成熟液(9.70 mg/mL TCM199+10%FBS+2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸鈉+0.02 U/mL FSH+0.12 U/mL LH+1 μg/mL E2)，將COCs隨機(jī)平分到四孔板中，放入39 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，在不同時(shí)間(0 h、30 min、1 h、2 h)，分別測(cè)定綿羊卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。

1.4 綿羊COCs的雙相體外成熟培養(yǎng)

在四孔板中分別加入：成熟液(9.70 mg/mL TCM199+10%FBS+2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸鈉+0.02 U/mL FSH+0.12 U/mL LH+1 μg/mL E2)，0.5 ng/mL E2，1 μg/mL E2，10 μmol/L 西洛酰胺的預(yù)成熟液(處理組加，對(duì)照組不加)，預(yù)成熟液為9.70 mg/mL TCM199 +2.38 mg/mL Hepes+0.20 mg/mL丙酮酸鈉+1 mg/mL無(wú)脂肪酸BSA。將COCs隨機(jī)平分到四孔板中，放入39 ℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。在0 h和2 h，分別測(cè)定綿羊卵母與卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平；2 h后將COCs轉(zhuǎn)移至正常成熟液的四孔板中，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h后，檢測(cè)生發(fā)泡破裂(GVBD)發(fā)生情況。

1.5 綿羊卵母與卵丘細(xì)胞cAMP水平測(cè)定

1.5.1 綿羊卵母與卵丘細(xì)胞樣品的制備

體外成熟培養(yǎng)不同時(shí)間后，取出四孔板，在0.3%透明質(zhì)酸酶中分離獲得卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞，隨后在0.1 mol/L HCl中靜置裂解30 min。裂解完成后吹打，1 000 r/min離心10 min，上清液用ELISA Buffer稀釋?zhuān)瑴u旋離心2次后，分別獲得卵母與卵丘細(xì)胞樣品，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。依次定量加入ELISA Buffer、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、cAMP乙酰膽堿酯酶示蹤劑和抗血清后，在4 ℃中孵育18 h，用Wash Buffer清洗拍干；再將Ellman’s試劑和Tracer加入指定孔中，室溫條件下?lián)u床避光孵育90～120 min；多功能酶標(biāo)儀在412 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣本中的cAMP水平。

1.6 DAPI染色

培養(yǎng)結(jié)束的COCs，置于含有0.3%透明質(zhì)酸酶中孵育5 min，移液槍反復(fù)吹打至裸卵，將其轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中，4 ℃過(guò)夜固定。固定完成后，用PBS洗滌3次，將裸卵轉(zhuǎn)移至載玻片，在蓋玻片上滴注粘片劑，進(jìn)行壓片至卵母細(xì)胞充滿(mǎn)卵周隙，1%Triton透化15 min，PBS洗滌卵母細(xì)胞，1 μg/mL的DAPI避光染色10 min，然后PBS再洗3次。在熒光顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞核狀態(tài)，并記錄每組GV期卵母細(xì)胞率、GVBD期卵母細(xì)胞率和MⅠ期卵母細(xì)胞率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗(yàn)均至少重復(fù)3次，用Excel軟件初步整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，再用ELISA Calc.exe和GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 西洛酰胺對(duì)綿羊卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響

2.1.1 cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)綿羊卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞裂解物中cAMP水平，結(jié)果顯示R2值為0.999 82，表明西洛酰胺含量與cAMP測(cè)定值具有良好的相關(guān)性，cAMP水平檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 添加西洛酰胺的cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.1.2 西洛酰胺對(duì)綿羊卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響

試驗(yàn)測(cè)定了PDE3抑制劑西洛酰胺(10 μmol/L)對(duì)體外成熟后綿羊卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化的時(shí)間效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

A. 卵母細(xì)胞cAMP水平；B. 卵丘細(xì)胞cAMP水平；每組10個(gè)COCs至少重復(fù)3次；同組之間比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同；*表示相同時(shí)間點(diǎn)組間差異顯著(P<0.05)，**表示相同時(shí)間點(diǎn)組間差異極顯著(P<0.01)；圖2 西洛酰胺對(duì)綿羊卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中cAMP水平的影響

由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組和處理組卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)30 min、1 h與2 h，cAMP水平均極顯著高于0 h(P<0.01)。與對(duì)照組比較，處理組卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平均有升高，其中30 min與2 h組分別顯示極顯著差異(P<0.01)與顯著差異(P<0.05)(圖 2A)；而卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平在30 min與2 h時(shí)，對(duì)照組和處理組中均無(wú)明顯變化，但添加處理1 h時(shí)，卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)(圖2B)。

2.2 雌二醇與西洛酰胺預(yù)處理對(duì)綿羊COCs內(nèi)cAMP水平的影響

2.2.1 cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)綿羊卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞裂解物中cAMP水平，cAMP水平檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。試驗(yàn)結(jié)果顯示，R2值為0.999 72，表明各試驗(yàn)組預(yù)處理與cAMP測(cè)定值具有良好的相關(guān)性。

圖3 E2與西洛酰胺預(yù)處理的cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.2 雌二醇與西洛酰胺預(yù)處理對(duì)綿羊COCs內(nèi)cAMP水平的影響

添加不同濃度E2(0.5 ng/mL或1 μg/mL)和西洛酰胺(10 μmol/L)體外預(yù)成熟培養(yǎng)2 h后，分別檢測(cè)綿羊卵母與卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，結(jié)果見(jiàn)圖4。在卵母細(xì)胞中，正常對(duì)照組，與0 h對(duì)照組cAMP水平相同，而預(yù)處理對(duì)照組的cAMP水平降低近1/2，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與預(yù)處理對(duì)照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2、西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平均明顯升高，且聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平最高，與預(yù)處理對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；1 μg/mL E2組相比于預(yù)處理對(duì)照組，cAMP水平略有升高，但差異不顯著(P>0.05)， 見(jiàn)圖4A。

在卵丘細(xì)胞中，與正常對(duì)照組相比，0 h對(duì)照組cAMP水平略低，而預(yù)處理對(duì)照組的cAMP水平降至約1/2水平，與預(yù)處理對(duì)照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平均顯著升高(P<0.05)，且均與預(yù)處理對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，而聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)相對(duì)于預(yù)處理對(duì)照組，其cAMP水平略有升高，而1 μg/mL E2組cAMP水平略微降低，但差異均不顯著(P>0.05)；另外，聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平相對(duì)于西洛酰胺組略有降低，而相對(duì)于1 μg/mL E2組cAMP水平略有升高，表明聯(lián)合添加可能存在拮抗效應(yīng)，而聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)cAMP水平相對(duì)于西洛酰胺組和0.5 ng/mL E2均有升高，表明聯(lián)合添加可能存在累加效應(yīng)，見(jiàn)圖4B。

A. 卵因細(xì)胞cAMP水平；B. 卵丘細(xì)胞cAMP水平；Cil是西洛酰胺的簡(jiǎn)稱(chēng)圖4 E2與西洛酰胺預(yù)處理COCs對(duì)cAMP水平的影響

2.3 雌二醇與西洛酰胺預(yù)處理COCs對(duì)綿羊卵母細(xì)胞核成熟的影響

為了驗(yàn)證cAMP水平變化對(duì)綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的影響，試驗(yàn)利用DAPI染色技術(shù)，觀察并記錄了處于GV、GVBD及MⅠ期卵母細(xì)胞核的狀態(tài)特征，觀察結(jié)果見(jiàn)圖5。GV期：染色質(zhì)呈絮狀、絲狀，可觀察到完整的核膜(圖5A)；GVBD期：核膜破裂，染色體高度濃縮，呈四分體形態(tài)(圖5B)；MⅠ期：染色體清晰可見(jiàn)，整齊地排列在赤道板上(圖5C)。

A. GV期；B. GVBD期；C. MⅠ期圖5 綿羊卵母細(xì)胞GV、GVBD及MⅠ核狀態(tài)

在雙相體外成熟系統(tǒng)中，測(cè)定不同濃度E2(0.5 ng/mL和1 μg/mL)和西洛酰胺(10 μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合添加對(duì)綿羊卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。各組在體外預(yù)成熟培養(yǎng)2 h和常規(guī)成熟培養(yǎng)4 h后，正常對(duì)照組GV期卵母細(xì)胞率為62.9%，預(yù)處理對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，GV期略有上升但差異不明顯(P>0.05)。與預(yù)處理對(duì)照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)GV期卵母細(xì)胞率顯著升高(P<0.05)，GVBD期卵母細(xì)胞率顯著降低(P<0.05)。1 μg/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)與預(yù)處理對(duì)照組、0.5 ng/mL E2組和西洛酰胺組及聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)比較，1 μg/mL E2組、西洛酰胺組與聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)之間卵母細(xì)胞各期比率無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 E2與西洛酰胺預(yù)處理COCs對(duì)綿羊卵母細(xì)胞核成熟的影響

3 討論

近年來(lái)關(guān)于家畜卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)改良已取得諸多進(jìn)展，但卵母細(xì)胞體外成熟的效率仍低于體內(nèi)成熟，這使得由體外成熟而來(lái)的家畜體外胚胎仍難以在育種實(shí)踐中被廣泛應(yīng)用[16]。當(dāng)前研究表明，cAMP調(diào)節(jié)劑在核成熟過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17-18]，因?yàn)閏AMP是參與減數(shù)分裂停滯和恢復(fù)的基本因素，它與進(jìn)一步的發(fā)育能力有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示，在體外成熟培養(yǎng)中，添加10 μmol/L西洛酰胺的效果最好[19]，因此，本研究在常規(guī)成熟體系中添加10 μmol/L的西洛酰胺，試圖探討其在含促性腺激素等在內(nèi)的體外成熟體系中，其對(duì)綿羊卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，分別添加西洛酰胺處理30 min與2 h時(shí)，可顯著提高卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。這與Buell等[20]研究結(jié)果相一致。在卵母細(xì)胞IVM期，添加Forskolin和IBMX處理30 min時(shí)，cAMP水平達(dá)到峰值。西洛酰胺是PDE3的特異性抑制劑[21]，但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在1 h時(shí)，西洛酰胺也可以顯著提高卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。這可能是由于前人與本試驗(yàn)研究的時(shí)間有所差異，或者是由于卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間的縫隙連接開(kāi)放[22]，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP流向卵丘細(xì)胞，使卵丘細(xì)胞內(nèi)cAMP水平有所增加。

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)在雙相IVM中的預(yù)處理階段添加10 μmol/L 西洛酰胺和不同濃度的E2(0.5 ng/mL和1 μg/mL)后，發(fā)現(xiàn)0 h對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，卵母細(xì)胞cAMP水平相同，而預(yù)處理對(duì)照組降至約1/2水平，說(shuō)明上述外源性激素可能具有維持卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的作用。對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，促性腺激素具有維持卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的作用[23]。在常規(guī)體外成熟培養(yǎng)6 h后，GV期卵母細(xì)胞率為62.9%，與Ni等[24]研究發(fā)現(xiàn)基本一致，其GV期卵母細(xì)胞率為67.2%。另外，與預(yù)處理對(duì)照組相比，西洛酰胺組cAMP水平顯著升高, 與本研究的結(jié)果相類(lèi)似。Park等[25]研究發(fā)現(xiàn)，用西洛酰胺預(yù)處理豬COCs，可顯著提高卵母細(xì)胞的cAMP水平。另外，與預(yù)處理對(duì)照組相比，西洛酰胺組GV期卵母細(xì)胞率顯著升高，GVBD期顯著降低。Gharibi等[26]研究發(fā)現(xiàn)，西洛酰胺能夠明顯阻滯體外成熟培養(yǎng)的綿羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。相對(duì)于預(yù)處理對(duì)照組，0.5 ng/mL E2組的cAMP水平和GV期卵母細(xì)胞率顯著升高，而GVBD期顯著降低；而1 μg/mL E2組的cAMP水平、GV期卵母細(xì)胞率與對(duì)照組及GVBD期差異不顯著。蔡姣[27]和張駿鴻[28]研究發(fā)現(xiàn)與本試驗(yàn)結(jié)果相似，添加低濃度(0.27 ng/mL或2.7 ng/mL)E2，可顯著促進(jìn)GV期卵母細(xì)胞率，而高濃度(1 μg/mL)E2，可顯著降低GV期卵母細(xì)胞率。此外，本試驗(yàn)聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)與預(yù)處理對(duì)照組相比，其cAMP水平與GV期卵母細(xì)胞率呈顯著差異，均高于單獨(dú)添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2組，表明聯(lián)合添加可能起到累加效應(yīng)。與預(yù)處理對(duì)照組相比，聯(lián)合添加組(西洛酰胺+1 μg/mL E2)cAMP水平明顯升高，且與0 h對(duì)照組呈顯著性差異，但其GV期卵母細(xì)胞率無(wú)顯著差異，表明高濃度雌激素與西洛酰胺聯(lián)合添加未起到最佳效果。而在卵丘細(xì)胞中顯示，與預(yù)處理對(duì)照組相比，西洛酰胺組、0.5 ng/mL E2組和聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)均顯著提高cAMP水平，聯(lián)合添加組(西洛酰胺+0.5 ng/mL E2)顯示最優(yōu)效果，且與0 h對(duì)照組呈顯著性差異。在目前的文獻(xiàn)中，尚未發(fā)現(xiàn)西洛酰胺和E2聯(lián)合添加的試驗(yàn)，這也是本試驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)之一。綜上，本研究在雙相體外成熟系統(tǒng)的預(yù)成熟階段，添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2，然后進(jìn)行常規(guī)IVM培養(yǎng)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的核質(zhì)同步成熟，進(jìn)而提高后續(xù)胚胎的發(fā)育能力。

4 結(jié)論

在IVM培養(yǎng)時(shí)添加西洛酰胺可以提高體外成熟綿羊卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平；利用西洛酰胺和0.5 ng/mL E2構(gòu)建綿羊卵母細(xì)胞體外“雙階段”成熟培養(yǎng)體系。在雙相IVM系統(tǒng)中，單獨(dú)或者聯(lián)合添加西洛酰胺和0.5 ng/mL E2預(yù)成熟培養(yǎng)2 h，能夠顯著提升卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，阻滯減數(shù)分裂進(jìn)程，對(duì)改善卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量具有積極作用。