倪 琦 林 化

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院1 科研部，2 重癥醫(yī)學(xué)科，南寧市 530023，電子郵箱：danilaile@sohu.com)

缺血-再灌注是導(dǎo)致急性腎損傷的常見原因，常見于腎臟外科手術(shù)、腎移植、腎臟體外沖擊波碎石等。缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)可引起腎小管上皮細(xì)胞缺血、壞死，甚至導(dǎo)致急性腎衰竭，其始動(dòng)因素是毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷，因此減輕血管內(nèi)皮損傷是預(yù)防和治療腎臟IRI的關(guān)鍵[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)作為多能造血干細(xì)胞之一，在生理或病理?xiàng)l件下可以從骨髓中動(dòng)員至外周血，并隨之遷移、歸巢至受損的組織、器官局部，參與損傷血管的修復(fù)[2]，目前已被廣泛應(yīng)用于缺血組織的血運(yùn)重建[3]。因此，促進(jìn)EPC向腎臟歸巢可能有利于腎臟毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，從而可改善腎臟的IRI。

姜黃素是從姜黃屬類植物根莖中提取的一種多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的藥理作用[4]。姜黃素還能夠保護(hù)或改善血管內(nèi)皮功能，對(duì)內(nèi)皮功能的恢復(fù)有著重要作用[5]。此外有研究表明，姜黃素可以減輕內(nèi)毒素休克誘發(fā)的兔急性腎損傷[6]。姜黃素不僅對(duì)腦、卵巢等器官的IRI具有保護(hù)作用[7-8]，還能通過提高血清超氧化物歧化酶含量、降低丙二醛含量，來減輕大鼠腎臟的IRI[9]。然而姜黃素能否通過趨化EPC促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)，從而發(fā)揮減輕缺血-再灌注所致急性腎損傷的作用，尚未見有相關(guān)研究。本研究通過建立大鼠腎臟IRI模型，探討姜黃素是否可以通過促進(jìn)EPC歸巢以修復(fù)損傷的腎臟毛細(xì)血管內(nèi)皮，從而改善缺血-再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：姜黃素(美國TargetMol公司，批號(hào)：T1516)，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)將姜黃素溶解至200 mg/mL；蘇木精染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BA-4097)；CD31抗體(美國Abcam公司，批號(hào)：ab182981)；兔抗大鼠 CD133抗體(美國Abcam公司，批號(hào)：ab19898)；小鼠抗大鼠CD34抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bsm-16538M)；辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司，批號(hào)：115-035-003)；Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗鼠IgG(美國Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：#8890)；Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG(美國Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：4412s)；阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫染色試劑盒(索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：G1285)。

1.1.2 儀器：全自動(dòng)脫水機(jī)(德國徠卡公司，型號(hào)：ASP300S)，全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(美國Thermo Scientific公司，型號(hào)：HM355S)，展烤片機(jī)(天津愛華醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：ZKPJ-1A型)，恒溫孵育箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DHP-9052)。

1.1.3 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)分組：雄性無特定病原體級(jí)SD大鼠24只，8～12周齡體重180～220 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證編號(hào):SCXK(桂)2014-0002]。大鼠飼養(yǎng)在室內(nèi)通風(fēng)及光線良好、溫度22 ℃、濕度50%的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、腎臟IRI模型組、陰性對(duì)照組、姜黃素干預(yù)組，每組6只。姜黃素干預(yù)組大鼠于造模前7 d開始腹腔注射姜黃素(200 mg/kg，1次/d)，陰性對(duì)照組予1 mL/kg的DMSO腹腔注射，姜黃素干預(yù)組和陰性對(duì)照組均于第7天給藥1 h后造模，正常對(duì)照組及腎臟IRI模型組均不給予DMSO、姜黃素及其他干預(yù)。

1.2 方法

1.2.1 建模：各組大鼠均于術(shù)前12 h禁食，自由飲水，稱重，10%水合氯醛(3.3 mL/kg)腹腔注射，充分麻醉后仰臥位固定于鼠板上，剪毛備皮、消毒，沿腹中線做4～5 cm的切口,逐層切開。用棉簽充分暴露大鼠左側(cè)腎臟，分離腎門周圍的結(jié)締組織和脂肪組織，充分暴露腎臟血管，保護(hù)輸尿管，用動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)脈，腎臟顏色由鮮紅色變暗紫色，說明缺血模型造模成功。40 min后松開動(dòng)脈夾，腎臟血流恢復(fù)，腎臟在十幾秒內(nèi)恢復(fù)為粉色。往腹腔中滴入無菌生理鹽水，逐層縫合肌肉、皮下組織和皮膚，碘附消毒切口后送回飼養(yǎng)籠，正常進(jìn)水、進(jìn)食，24 h后處死各組大鼠，摘取左側(cè)腎臟，最大切面剖成兩半，一半固定于10%中性福爾馬林溶液中待檢，另一半于-80℃保存。

1.2.2 阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫染色：取出固定于10%中性福爾馬林溶液的腎組織，脫水，石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，水洗3 min，阿利新藍(lán)染色液染色20 min，蒸餾水洗滌，高碘酸中氧化5 min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗，雪夫試劑浸染20 min，流水沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，蒸餾水水洗，分化液分化2～5 s，蒸餾水水洗，Scott藍(lán)化液返藍(lán)，水洗，逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。分別于每張切片腎皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)取5個(gè)視野(200倍鏡)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下擴(kuò)張腎小管的數(shù)量(取平均值)。

1.2.3 免疫熒光雙染檢測：腎組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，血清封閉，滴加一抗兔抗大鼠CD133抗體(1 ∶100)、小鼠抗大鼠CD34抗體(1 ∶100)，4℃過夜，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗片，滴加Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗鼠IgG(1 ∶500)和Alexa Flour 488標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1 ∶500)，37℃孵育0.5 h，PBS洗片，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)，PBS洗片，封片。CD133陽性細(xì)胞為綠色熒光，CD34陽性細(xì)胞為紅色熒光，CD133/CD34雙陽性細(xì)胞即為EPC，顯示為黃色熒光。

1.2.4 免疫組化染色：腎組織石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)、3%過氧化氫封閉，血清封閉，加入CD31抗體(1 ∶2 000)，4℃過夜，PBS洗片后，加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG(1 ∶300)，37℃孵育0.5 h，洗片后加二氨基聯(lián)苯胺顯色3 min，自來水沖洗，逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用Image-Pro Plus圖像軟件分析免疫組化染色結(jié)果，每張切片于200倍鏡的視野下采集10張圖像，細(xì)胞胞質(zhì)可見棕黃色顆粒表達(dá)(即為陽性區(qū)域)，計(jì)算陽性區(qū)域的平均光密度值。CD31廣泛表達(dá)于腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，其光密度值反映CD31蛋白表達(dá)量，可以間接反映腎小管周圍毛細(xì)血管的密度，光密度值越大，表示腎小管周圍毛細(xì)血管的密度越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)腎臟IRI大鼠腎小管損傷情況的影響 阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常。與正常對(duì)照組相比，腎臟IRI模型組出現(xiàn)較多的擴(kuò)張腎小管，小管上皮細(xì)胞扁平，還有部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，小管結(jié)構(gòu)不清楚，腎間質(zhì)局部可見炎細(xì)胞浸潤，腎小球基底膜略微增厚。陰性對(duì)照組腎小管的情況與腎臟IRI模型組相同。與正常對(duì)照組相比，姜黃素預(yù)處理組也有少量擴(kuò)張腎小管、上皮細(xì)胞腫脹，但擴(kuò)張腎小管數(shù)目較腎臟IRI模型組減少，炎細(xì)胞浸潤較少，腎小球基底膜正常。見圖1。

腎臟IRI模型組和陰性對(duì)照組的擴(kuò)張腎小管數(shù)量較正常對(duì)照組增多(均P<0.05)，陰性對(duì)照組與腎臟IRI模型組的擴(kuò)張腎小管數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素干預(yù)組的擴(kuò)張腎小管數(shù)量較腎臟IRI模型組和陰性對(duì)照組減少(均P<0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠腎臟組織阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫染色情況(黑色星狀圖標(biāo)代表擴(kuò)張腎小管)

表1 4組大鼠擴(kuò)張腎小管數(shù)量的比較(x±s，個(gè))

2.2 姜黃素對(duì)腎臟IRI大鼠腎組織EPC歸巢的影響 腎臟IRI模型組和陰性對(duì)照組腎組織EPC數(shù)量較正常對(duì)照組增多(均P<0.05)；陰性對(duì)照組與腎臟IRI模型組腎組織EPC數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而姜黃素干預(yù)組腎組織EPC數(shù)量較腎臟IRI模型組和陰性對(duì)照組增加(均P<0.05)。見表2、圖2。

表2 4組大鼠腎組織EPC數(shù)量的比較(x±s，個(gè))

圖2 各組大鼠腎組織CD133/CD34免疫熒光雙重染色情況

2.3 姜黃素對(duì)腎臟IRI大鼠腎組織CD31表達(dá)的影響 正常對(duì)照組CD31廣泛表達(dá)于腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，呈黃色顆粒狀分布于細(xì)胞質(zhì)中。腎臟IRI模型組腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD31陽性細(xì)胞顯著減少。陰性對(duì)照組腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD31陽性細(xì)胞表達(dá)情況與腎臟IRI模型組相當(dāng)。姜黃素干預(yù)組較腎臟IRI模型組腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31陽性細(xì)胞增多。見圖3。

腎臟IRI模型組和陰性對(duì)照組腎小管周圍CD31表達(dá)較正常對(duì)照組減少(均P<0.05)，陰性對(duì)照組與腎臟IRI模型組腎小管周圍CD31表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素干預(yù)組腎小管周圍CD31表達(dá)較正常對(duì)照組減少，但較腎臟IRI模型組和陰性對(duì)照組增多(均P<0.05)。見表3。

圖3 各組大鼠腎組織中CD31的表達(dá)情況

表3 4組大鼠腎臟CD31表達(dá)的比較(x±s)

3 討 論

腎臟IRI源于血管內(nèi)皮的損傷，腎間質(zhì)血管內(nèi)皮損傷致血管腔狹窄，造成“無復(fù)流現(xiàn)象”，使腎小管上皮細(xì)胞攝取的氧和營養(yǎng)物質(zhì)減少，導(dǎo)致其缺血、壞死，修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞可預(yù)防或減輕腎小管上皮細(xì)胞的損傷，因此血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)尤為重要[1]。干細(xì)胞技術(shù)尤其是EPC在組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用，受到越來越多的關(guān)注。EPC是一種骨髓源性的干細(xì)胞，通過動(dòng)員、趨化、歸巢、增殖和分化等多個(gè)過程參與損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)[10]。組織缺氧或血管內(nèi)皮損傷時(shí)，EPC被動(dòng)員到外周血中，經(jīng)過遷移、歸巢到內(nèi)皮損傷部位并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與損傷內(nèi)皮的修復(fù)及新生血管的生成。因此，EPC是血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的主要來源，是防治腎臟IRI的重要靶點(diǎn)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，EPC可通過促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡、降低炎癥水平和纖維化來減輕缺血誘導(dǎo)的急性腎損傷[11]。而組織損傷時(shí)EPC從骨髓中釋放出來后能否有效遷移、歸巢至受損部位，是血管再生和損傷修復(fù)的關(guān)鍵。多種中藥有效單體和中藥復(fù)方可以促進(jìn)EPC的動(dòng)員，具有促進(jìn)EPC增殖、遷移、分化及形成血管能力等作用[12]。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根莖中提取的一種植物多酚。曾松柏等[13]的研究表明，姜黃素可以上調(diào)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，而血管內(nèi)皮生長因子參與血管新生過程，不僅可以誘導(dǎo)EPC向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)還是EPC的重要趨化因子。

腎小管是腎臟中對(duì)缺血性損傷時(shí)最敏感的部位。缺血-再灌注后腎小管上皮細(xì)胞壞死、萎縮和凋亡，腎小管管腔擴(kuò)大，并且壞死的腎小管上皮細(xì)胞脫落，形成細(xì)胞碎片，導(dǎo)致局部間質(zhì)的炎癥浸潤，因此腎小管擴(kuò)張是急性腎損傷的重要病理改變。本研究結(jié)果顯示，腎臟IRI模型組的擴(kuò)張腎小管數(shù)量較正常對(duì)照組增多，而姜黃素干預(yù)組的擴(kuò)張腎小管數(shù)量較腎臟IRI模型組減少(P<0.05)，說明姜黃素預(yù)處理可以減輕缺血-再灌注誘導(dǎo)的腎小管損傷。

缺血-再灌注過程有可能損傷腎小管周圍的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起腎小管周圍毛細(xì)血管破壞，從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞供血、供氧不足，影響腎小管正常的組織結(jié)構(gòu)和功能。CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志因子，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在腎臟中見于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，CD31染色可以反映腎臟毛細(xì)血管的走行和微血管密度[14]。本研究結(jié)果顯示，腎臟IRI模型組腎小管周圍CD31表達(dá)量較正常對(duì)照組減少，而姜黃素干預(yù)組腎小管周圍CD31表達(dá)量較腎臟IRI模型組增高(P<0.05)，表明姜黃素預(yù)處理可促進(jìn)腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。在腎損傷時(shí)，EPC歸巢至損傷部位，增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮的損傷修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，腎臟IRI模型組腎臟EPC含量較正常對(duì)照組增多，而姜黃素干預(yù)組腎臟EPC含量較腎臟IRI模型組進(jìn)一步增多(P<0.05)，提示姜黃素預(yù)處理促進(jìn)EPC歸巢。因此我們推測姜黃素有可能通過促進(jìn)EPC歸巢，以修復(fù)腎小管周圍毛細(xì)血管損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，從而改善IRI誘導(dǎo)的急性腎損傷。

干細(xì)胞治療已經(jīng)成為腎臟IRI的治療新方向，但目前尚未找到EPC有效的激活劑。姜黃素作為我國的傳統(tǒng)中藥，具有藥物安全濃度范圍大、毒副作用小、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，可用于治療腎臟IRI，也可以作為EPC有效的激活劑應(yīng)用于血管再生治療，其有可能成為干細(xì)胞治療的輔助性用藥。但姜黃素促進(jìn)EPC歸巢及血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的具體機(jī)制及通路仍有待于進(jìn)一步深入研究。