張 玲 陳 堯 程 超 趙志剛

(湖北省黃石市中醫(yī)醫(yī)院1 麻醉科，2 骨科，黃石市 435000，電子郵箱:dzyx_13@163.com；3 湖北省武漢市普愛醫(yī)院微創(chuàng)脊柱外科，武漢市 430032)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是骨科常見疾病，我國(guó)每年新患病人數(shù)約為150萬例，近年來隨著我國(guó)老齡化加劇其發(fā)病率逐年升高[1]。對(duì)于保守治療無效的LDH，手術(shù)效果確切，是重要的治療手段，但手術(shù)具有創(chuàng)傷性，且麻醉可影響患者認(rèn)知功能，導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)發(fā)生率高[2]。研究顯示，在非心臟大手術(shù)后的出院患者中，老年患者POCD發(fā)生率達(dá)40%，40歲以下患者POCD發(fā)生率也達(dá)36%，POCD對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[3]。研究表明，手術(shù)等創(chuàng)傷性操作可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)激，免疫應(yīng)激可引起炎癥反應(yīng)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的炎癥反應(yīng)，繼而可引發(fā)POCD[4]。另有研究證實(shí)，異氟醚麻醉是誘發(fā)CNS炎癥反應(yīng)的重要因素[5]，但具體機(jī)制仍不明確。因此，明確異氟醚麻醉誘發(fā)CNS炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，對(duì)臨床上預(yù)防POCD的發(fā)生有重要意義。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS中重要的免疫細(xì)胞，其活化水平與炎癥反應(yīng)進(jìn)展關(guān)系密切。本研究采用異氟醚麻醉成年大鼠后建立LDH大鼠模型，誘導(dǎo)CNS炎癥反應(yīng)，觀察建模后大鼠海馬組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)情況，探究CNS炎癥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制，為POCD的預(yù)防提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級(jí)雄性SD大鼠40只，3月齡，體質(zhì)量230～270 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。大鼠自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)于12 h明暗交替、濕度為50%～60%、室溫為22℃～25℃的環(huán)境，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合減少、替代和優(yōu)化的原則。

1.2 主要試劑和儀器 異氟醚(山東魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)：20201305)，兔抗大鼠離子鈣結(jié)合銜接分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1；美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab10354)，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SA0011)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、防淬滅封片劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C1002、P0131-5)，兔抗大鼠含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain containing 3,NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase1)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptotic-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)多抗(美國(guó)ZenBio公司，批號(hào)：30895、35602，BK-K5533)，山羊抗兔熒光二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AMJ-AB2011)，白細(xì)胞介素 1β(interleukin，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司，批號(hào)：HS2098、MTA00B)，二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：23227)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、條件恐懼實(shí)驗(yàn)器材(上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)：XR-XC404)，激光共聚焦顯微鏡、切片機(jī)(德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司，型號(hào)：SP8、SM2010R)，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：CheniDoc XRS)。

1.3 分組及建模方法 采用體質(zhì)量排序隨機(jī)分組法將40只大鼠分為對(duì)照組10只、模型組30只。參照文獻(xiàn)[6]，采用自體髓核移植法，取模型組大鼠建立LDH模型，將大鼠置于連接小動(dòng)物麻醉機(jī)的透明盒中，調(diào)節(jié)異氟醚吸入濃度為2.0%，誘導(dǎo)麻醉后取出，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，以2.0%異氟醚通過呼吸面罩維持麻醉。無菌條件下距尾根約4 cm處斷尾，切開尾部椎間盤，取椎間盤髓核組織約4 g，置于無菌生理鹽水中備用，縫合傷口。背部剃毛消毒，沿背正中做4 cm切口，鈍性分離皮膚、筋膜及肌肉，行L5、L6左側(cè)椎板和部分上下關(guān)節(jié)突切除術(shù)，暴露馬尾神經(jīng)及左側(cè)L5神經(jīng)根；將自體髓核組織放置于L5背根神經(jīng)節(jié)硬膜囊交界處，采用4-0腸線環(huán)扎L5、L6神經(jīng)根，以腸線接觸神經(jīng)根但無明顯壓迫為宜，局部固定牢固，逐層縫合傷口。建模后1～3 d每只大鼠腹腔注射青霉素預(yù)防感染。對(duì)照組不進(jìn)行麻醉和手術(shù)操作。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)觀察：建模后第1天，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及條件恐懼實(shí)驗(yàn)觀察大鼠行為學(xué)。(1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。將大鼠放入曠場(chǎng)(長(zhǎng)×寬×高為100 cm×100 cm×50 cm)底面中心，攝像系統(tǒng)記錄大鼠5 min內(nèi)在曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清理糞便并用75%酒精擦拭曠場(chǎng)底部和內(nèi)壁。(2)條件恐懼實(shí)驗(yàn)。將大鼠置于測(cè)試箱中適應(yīng)3 min，然后給予3.0 kHz、65 dB聲音刺激，時(shí)間為30 s，最后2 s同時(shí)給予0.7 mA足底電擊，聲音及電刺激結(jié)束后，繼續(xù)在測(cè)試箱中停留2 min后，放回飼養(yǎng)籠。24 h后，再次將大鼠放置測(cè)試箱內(nèi)，不給予刺激，記錄3 min內(nèi)環(huán)境誘發(fā)僵直行為。2 h后改變測(cè)試箱箱底顏色，再次放入大鼠，給予相同參數(shù)聲音刺激3 min，記錄3 min內(nèi)環(huán)境或聲音誘發(fā)僵直時(shí)間占比，僵直時(shí)間占比=僵直時(shí)間/3 min×100%。

1.4.2 病理組織標(biāo)本采集：行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，于建模后2、4、8 d，按照隨機(jī)數(shù)字表法各選取10只模型組大鼠分批處死，并于實(shí)驗(yàn)開始后2 d將對(duì)照組10只大鼠全部處死。按照隨機(jī)數(shù)字表法，對(duì)照組取5只、模型組每批次取5只大鼠，剖開胸腔，剪開右心耳，從左心室快速灌注預(yù)熱生理鹽水，至流出灌注液無血色，再緩慢灌注200 mL 4%多聚甲醛固定。斷頭，分離小腦，取雙側(cè)海馬組織，將左右側(cè)海馬組織分瓶保存于4%多聚甲醛中固定備用。對(duì)照組和模型組其余大鼠僅心臟灌注生理鹽水后，快速斷頭后取雙側(cè)海馬組織，左右側(cè)分開保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)：取保存于4%多聚甲醛的左側(cè)海馬組織，制備厚度為10 μm的冰凍切片，切片經(jīng)3% H2O2孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌，0.3% Triton X-100于37℃孵育25 min，牛血清白蛋白封閉30 min，加入一抗兔抗大鼠Iba-1(1 ∶800)，4℃孵育過夜，PBS洗滌，加入SABC試劑盒中生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，室溫孵育2 h；PBS洗滌后加入SABC孵育1 h，PBS洗滌后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)。每張切片取高倍鏡(×400倍)下5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，5個(gè)視野計(jì)數(shù)之和為每張切片內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)。

1.4.4 小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3活化情況檢測(cè)：取保存于4%多聚甲醛中的右側(cè)海馬組織，制備厚度為8 μm的冰凍切片，PBS洗滌后加入10%山羊血清室溫封閉1.5 h，棄去血清勿洗滌，加入兔抗大鼠NLRP3稀釋抗體(1 ∶50)，4℃孵育過夜，PBS洗滌，加入羅丹明與山羊抗兔熒光二抗(1 ∶100)混合液，避光室溫孵育2.5 h，PBS洗滌，加入DAPI核染6 min；PBS洗滌加入抗熒光淬滅劑，暗室中于激光共聚焦顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3活化情況，其中紅色熒光為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)活化的NLRP3，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。

1.4.5 海馬組織IL-1β、TNF-α水平檢測(cè)：取保存于-80℃的左側(cè)海馬組織，組織剪剪碎后，勻漿，3 000 r/min離心12 min取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平，按照試劑盒說明書要求操作，于全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher，型號(hào)：Multiskan SkyHigh)上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本濃度。

1.4.6 海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達(dá)量檢測(cè)：取保存于-80℃的右側(cè)海馬組織，加入液氮研磨后加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min 離心15 min取上清液，進(jìn)行二喹啉甲酸蛋白定量；取50 μg蛋白樣本與等體積上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min變性，室溫1 2000 r/min離心15 min取上清液，蛋白上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉1 h 后，加入稀釋的一抗(1 ∶500)于4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次，加入稀釋的二抗(1 ∶2 000)于室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，暗室中曝光、顯影。于凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，采用灰度值分析軟件分析蛋白條帶的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參(美國(guó)Abcam公司，型號(hào)：Ab9485)。以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料均以(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況 造模后，模型組大鼠跛行，術(shù)側(cè)后爪屈曲、握緊或下垂，休息時(shí)出現(xiàn)反復(fù)舔舐術(shù)側(cè)后爪，或輕咬趾甲現(xiàn)象，但均未造成趾甲脫落；除運(yùn)動(dòng)功能缺陷外，大鼠還出現(xiàn)煩躁、食量減少、毛發(fā)無光澤等現(xiàn)象，隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，以上癥狀加重。對(duì)照組無上述癥狀，一般情況均正常。提示本研究中模型組大鼠均造模成功。

2.2 兩組大鼠行為學(xué)指標(biāo)的比較 模型組環(huán)境誘發(fā)僵直時(shí)間占比較對(duì)照組降低(P<0.05)；兩組中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間、聲音誘發(fā)僵直時(shí)間占比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠行為學(xué)指標(biāo)的比較(x±s)

2.3 兩組大鼠海馬組織CA1區(qū)Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量 免疫組化染色結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組建模后2、4、8 d海馬組織CA1區(qū)Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量分別為(658.40±15.58)個(gè)/視野、(1 033.20±25.06)個(gè)/視野、(859.60±22.13)個(gè)/視野、(725.40±18.97)個(gè)/視野，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=636.513，P<0.001)。與對(duì)照組比較，模型組建模后2、4、8 d小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均增多(均P<0.05)，但模型組建模后2、4、8 d小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量依次減少 (均P<0.05)。見圖1。

圖1 各組海馬組織CA1區(qū)Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞(免疫組化染色，×40)

2.4 兩組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3活化情況 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，對(duì)照組海馬組織細(xì)胞質(zhì)活化NLRP3較少，模型組建模后2 d海馬組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NLRP3大量激活，隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)活化NLRP3逐漸減少，建模后8 d最少。見圖2。

圖2 免疫熒光染色觀察海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3(激光共聚焦顯微鏡，×400)

2.5 兩組海馬組織IL-1β、TNF-α水平的比較 與對(duì)照組比較，模型組建模后2 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平及建模后4 d TNF-α水平升高(均P<0.05)；與模型組建模后2 d比較，建模后4 d、8 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)，但建模后4 d與8 d比較，海馬組織IL-1β、TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 兩組海馬組織IL-1β、TNF-α水平的比較(x±s)

2.6 兩組大鼠海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達(dá)情況的比較 與對(duì)照組比較，模型組建模后2、4、8 d海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(均P<0.05)；隨建模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低(均P<0.05)。見圖3和表3。

圖3 兩組大鼠海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達(dá)情況

表3 兩組大鼠海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，全球手術(shù)量劇增，但術(shù)后并發(fā)癥也急劇增多，其中POCD是多種手術(shù)術(shù)后常見的并發(fā)癥，而腹部手術(shù)、骨科手術(shù)術(shù)后POCD發(fā)病率明顯高于其他類型的手術(shù)[7]。研究顯示，患者年齡、基礎(chǔ)疾病、受教育水平及麻醉用藥與POCD的發(fā)病密切相關(guān)[8]。但POCD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，而CNS炎癥反應(yīng)學(xué)說已得到研究學(xué)者廣泛認(rèn)可。海馬是CNS中與學(xué)習(xí)、認(rèn)知關(guān)系密切的重要腦區(qū)[9]，了解海馬區(qū)炎癥反應(yīng)對(duì)探討CNS功能障礙的發(fā)生機(jī)制有重要意義。異氟醚是臨床常用的麻醉藥物，但有研究顯示異氟醚麻醉是誘發(fā)CNS炎癥反應(yīng)的重要因素[5]。本研究采用異氟醚麻醉成年大鼠后建立LDH大鼠模型，觀察建模后小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)的情況，探討CNS炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制。

Zhu等[10]應(yīng)用異氟醚吸入麻醉建立POCD小鼠模型，結(jié)果顯示外周免疫細(xì)胞可透過血腦屏障引起海馬區(qū)炎癥反應(yīng)，加重異氟醚所致的POCD。Wang等[11]采用1.5%異氟醚麻醉小鼠，1周后對(duì)其進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)POCD，且海馬組織IL-1β、IL-18炎癥因子水平升高。上述研究均提示異氟醚麻醉可導(dǎo)致CNS功能障礙及海馬組織炎癥反應(yīng)。本研究的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組大鼠中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明異氟醚麻醉對(duì)LDH大鼠的機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能無明顯傷害；條件恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組環(huán)境誘發(fā)僵直時(shí)間占比低于對(duì)照組(P<0.05)，但兩組聲音誘發(fā)僵直時(shí)間占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明異氟醚麻醉可造成LDH大鼠海馬依賴性記憶(環(huán)境誘發(fā)僵直)受損，而對(duì)非海馬依賴性記憶(聲音誘發(fā)僵直)無明顯影響。而本研究模型組建模后2 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平升高，與既往研究結(jié)果[12]相符；建模后4 d、8 d海馬組織IL-1β、TNF-α水平低于建模后2 d，說明異氟醚對(duì)LDH大鼠造成的海馬組織炎癥有自行減輕的趨勢(shì)。

小膠質(zhì)細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要防線，正常生理情況下處于靜息狀態(tài)，當(dāng)CNS處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，并持續(xù)釋放炎癥介質(zhì)(如IL-1β、TNF-α)，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致CNS功能受損，造成腦認(rèn)知功能受損[13]。Karpenko等[14]發(fā)現(xiàn)，帕金森病患者腦脊液中IL-1β、TNF-α水平顯著升高，且與病程、認(rèn)知功能受損程度關(guān)系密切。NLRP3主要存在于小膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)，由病原菌、應(yīng)激等刺激信號(hào)激活，通過募集接頭蛋白ASC，激活下游Caspase1，進(jìn)而將前體IL-1β加工為成熟IL-1β，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)[15-16]。Li等[17]敲除雄性C57BL/6小鼠的NLRP3基因后，發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)空氣污染顆粒誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性及炎癥反應(yīng)減輕，海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶損害得以改善。上述研究均說明小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3活化在CNS炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，模型組建模后2、4、8 d小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，NLRP3活化水平升高，且海馬組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，但隨建模時(shí)間的延長(zhǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、NLRP3活化水平及NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達(dá)均逐漸降低(P<0.05)。提示異氟醚全麻可能通過促進(jìn)LDH大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中NLRP3活化以上調(diào)IL-1β、TNF-α表達(dá)，從而引發(fā)LDH大鼠的CNS炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步提示抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3活化對(duì)防治POCD具有潛在價(jià)值。

綜上所述，應(yīng)用異氟醚進(jìn)行全身麻醉可能通過促進(jìn)LDH大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中NLRP3的活化從而誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致CNS炎癥反應(yīng)的發(fā)生。