馮漢青，王建荷，張悅婧，李 穎，龐海龍

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

三磷酸腺苷(ATP)存在于所有類型的細(xì)胞中，并作為細(xì)胞內(nèi)能源物質(zhì)參與細(xì)胞新陳代謝.近年來(lái)的研究表明，植物細(xì)胞可通過(guò)多種機(jī)制(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、胞吐作用和PM-ANT1轉(zhuǎn)運(yùn)體等)將細(xì)胞內(nèi)ATP(iATP)從胞漿釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，從而形成細(xì)胞外ATP(eATP)，并作為信號(hào)分子發(fā)揮作用[1-3].研究發(fā)現(xiàn)，eATP參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞的活力以及根毛生長(zhǎng)等多種生理過(guò)程[4].由于eATP具有較高的極性，無(wú)法通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，因此，質(zhì)膜上的eATP受體蛋白在eATP識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著關(guān)鍵角色[5].Choi等[6]已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)和鑒定了第1個(gè)eATP受體DORN1，并揭示了eATP通過(guò)DORN1的介導(dǎo)引起細(xì)胞質(zhì)中[Ca2+]，NO和ROS等二級(jí)信號(hào)的產(chǎn)生，從而調(diào)控植物的各種生理響應(yīng)，這使得eATP的研究進(jìn)入新階段.

在植物光合作用過(guò)程中，呼吸鏈對(duì)植物光合作用過(guò)程的正常運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要作用[7-8].其中最為重要的證據(jù)之一是：高等植物中交替呼吸途徑的抑制劑能夠降低植物的PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)水平[9].交替呼吸途徑是以交替氧化酶(AOX)為末端氧化酶，可使電子繞過(guò)細(xì)胞色素途徑中的復(fù)合體Ⅲ和復(fù)合體Ⅳ兩個(gè)ATP合成位點(diǎn)，在泛醌處分支，電子不經(jīng)跨膜就將O2還原為H2O.因此，交替呼吸途經(jīng)比細(xì)胞色素途徑損失了2個(gè)ATP合成位點(diǎn)，只能產(chǎn)生較少的ATP，將剩余能量以熱的形式釋放[10].目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，交替呼吸途徑能夠減少葉綠體內(nèi)NADPH的過(guò)量累積，從而優(yōu)化光合的能量代謝，并抵御和減弱PSⅡ光抑制的發(fā)生[11].

已有研究報(bào)道，eATP可通過(guò)Ca2+和H2O2來(lái)調(diào)節(jié)PSⅡ的光化學(xué)活性[12].但是否呼吸鏈對(duì)植物光化學(xué)反應(yīng)的影響也受到eATP的調(diào)控則尚無(wú)明確報(bào)道.基于此，文中以野生型(WT)和eATP受體缺失突變體(dorn-1)擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，以植物呼吸鏈中交替呼吸途徑的抑制劑水楊基氧肟酸(SHAM)為工具，通過(guò)測(cè)量葉綠素?zé)晒鈪?shù)探討了eATP參與調(diào)控呼吸鏈對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的影響，以期進(jìn)一步了解eATP對(duì)植物光合效率的生理調(diào)控作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與方法

所用材料為野生型(WT， Columbia Col-0)擬南芥和eATP受體缺失突變體(dorn-1，從俄亥俄州立大學(xué)的擬南芥生物資源中心獲得)擬南芥(Arabidopsisthaliana).擬南芥種子置于蒸餾水中，在4 ℃、黑暗條件下春化3 d后，將種子栽種于含有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石(2∶1)混合物的培養(yǎng)基質(zhì)中，每盆1株.每隔2～3 d澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液保證表層培養(yǎng)基質(zhì)濕潤(rùn)，在溫度為(25±2)℃、光照強(qiáng)度為150 μmol·m-2·s-1、光周期為16 h光照和8 h黑暗的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng).

選取4～5周苗齡、長(zhǎng)勢(shì)一致的擬南芥幼苗作為供試材料.分別配制1 mmol·L-1SHAM溶液、20 μmol·L-1ATP溶液和1 mmol·L-1SHAM+20 μmol·L-1ATP混合液，對(duì)照組用蒸餾水處理.將擬南芥葉片在不離體狀態(tài)下完整浸泡于上述溶液中1 h后，測(cè)定相應(yīng)指標(biāo).對(duì)葉片的上述處理均在(25±2)℃、 150 μmol·m-2·s-1條件下進(jìn)行.

1.2 交替呼吸途徑容量的測(cè)定

依據(jù)Bingham等[13]方法，采用Clark型氧電極測(cè)定交替呼吸途徑容量.將葉片稱重并剪碎，加入KCN測(cè)量葉片耗氧速率；同時(shí)加入KCN和SHAM測(cè)量葉片的剩余呼吸速率，交替呼吸途徑容量為KCN存在下葉片耗氧速率和剩余呼吸速率的差值.

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行4次獨(dú)立重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用SPSS 20.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較和顯著性差異水平分析(P<0.05).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 呼吸鏈抑制劑SHAM對(duì)WT葉片交替呼吸和光化學(xué)活性的影響

用1 mmol·L-1交替呼吸鏈抑制劑SHAM處理WT葉片后，交替呼吸途徑容量(Valt)相較于對(duì)照組顯著降低了76.4%(圖1).該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SHAM能夠引起WT葉片的交替呼吸途徑容量的下降.

用1 mmol·L-1SHAM 處理WT葉片后發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，SHAM的處理使得WT葉片Y(Ⅱ),RET,qp和Y(NO)顯著降低了22.8%,19.3%,12.1%和12.0%；同時(shí)，QNP和Y(NPQ)顯著上升了10.6%和9.6%(表1).這表明呼吸鏈中交替呼吸途徑的抑制降低了WT葉片PSⅡ反應(yīng)中心的開放比例及PSⅡ光化學(xué)運(yùn)行效率，提高了葉片的光能耗散.

CK為對(duì)照組，SHAM為1 mmol·L-1 SHAM，不同小寫字母表示在P<0.05水平有顯著差異，下同

2.2 呼吸鏈抑制劑SHAM對(duì)dorn-1葉片光化學(xué)活性的影響

進(jìn)一步研究了SHAM對(duì)dorn-1葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入1 mmol·L-1SHAM抑制交替呼吸途徑后，與對(duì)照組相比，dorn-1葉片的Y(Ⅱ),RET,qp,QNP,Y(NPQ)和Y(NO)均未發(fā)生顯著性變化(表1).表明呼吸鏈中交替呼吸途徑的抑制并未引起dorn-1葉片PSⅡ反應(yīng)中心的開放比例及PSⅡ的光化學(xué)效率的變化，也沒有刺激葉片的光能耗散.

2.3 外源ATP對(duì)交替呼吸抑制后WT葉片光化學(xué)活性的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，單獨(dú)施加20 μmol·L-1外源ATP均未引起WT葉片Y(Ⅱ),RET,qp,QNP,Y(NPQ)和Y(NO)的顯著性變化.當(dāng)交替呼吸途徑被SHAM抑制后，相較于對(duì)照組和外源ATP單獨(dú)處理組，WT葉片的Y(Ⅱ),RET,qp和Y(NO)顯著降低，同時(shí)QNP和Y(NPQ)顯著增加.對(duì)SHAM處理的WT葉片進(jìn)行外源ATP的處理， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 外源ATP顯著緩解了SHAM引起的Y(Ⅱ)，RET和qp的下降以及 Y(NPQ)的上升(與SHAM單獨(dú)處理組相比，外源ATP和SHAM共同施加使得Y(Ⅱ),RET和qp分別上升了26.9%,21.1%和23.4%，而使得Y(NPQ)下降了8.2%)；另外，與SHAM單獨(dú)處理組相比，外源ATP和SHAM共同施加使WT葉片的QNP下降了5%，同時(shí)使Y(NO)上升了5%.上述結(jié)果表明，抑制交替呼吸途徑對(duì)WT葉片的光化學(xué)活性的影響受到外源ATP的調(diào)節(jié).

表1 SHAM對(duì)2種擬南芥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

CK為對(duì)照組,ATP濃度為20 μmol·L-1,SHAM濃度為1 mmol·L-1,SHAM+ATP表示1 mmol·L-1 SHAM+20 μmol·L-1 ATP,下同

2.4 外源ATP對(duì)交替呼吸抑制后dorn-1葉片光化學(xué)活性的影響

相較于對(duì)照組，單獨(dú)添加20 μmol·L-1外源ATP均未引起dorn-1葉片Y(Ⅱ)，RET，qp，QNP,Y(NPQ)和Y(NO)的顯著性變化；當(dāng)加入1 mmol·L-1SHAM抑制交替呼吸途徑后，相較于對(duì)照組和外源ATP單獨(dú)處理組，發(fā)現(xiàn)dorn-1葉片的Y(Ⅱ),RET,qp,QNP,Y(NPQ)和Y(NO)均未發(fā)生顯著性變化(圖3).對(duì)SHAM處理的葉片進(jìn)行外源ATP的處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于SHAM單獨(dú)處理組，外源ATP和SHAM的共同施加也未引起dorn-1葉片Y(Ⅱ),RET,qp,QNP,Y(NPQ)和Y(NO)的顯著性變化.由此說(shuō)明，在eATP受體DORN1缺失的情況下，交替呼吸途徑的抑制無(wú)法引起植株光化學(xué)活性的顯著變化，同時(shí)外源ATP也無(wú)法產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)交替呼吸途徑抑制劑SHAM引起了擬南芥交替呼吸容量的降低.進(jìn)一步研究表明，SHAM的處理能引起WT葉片光化學(xué)水平的降低，而對(duì)DORN1葉片無(wú)顯著影響，表明eATP受體的缺失降低了光化學(xué)反應(yīng)對(duì)交替呼吸途徑抑制劑的敏感性,暗示交替呼吸途徑的抑制對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的影響和eATP存在一定的關(guān)系.傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，在光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，PSⅡ的光損傷是不可避免的結(jié)果[17].在光損傷過(guò)程中，光合電子傳遞鏈的氧化還原組件與O2反應(yīng)生成ROS，而ROS可抑制D1蛋白的合成，進(jìn)而加劇光損傷[18-20].而葉綠體中產(chǎn)生的過(guò)多還原力可轉(zhuǎn)至線粒體，并通過(guò)交替呼吸途徑進(jìn)行耗散，以減少葉綠體內(nèi)ROS的積累，進(jìn)而保護(hù)葉綠體免受光脅迫的破壞并有助于修復(fù)受損的PSⅡ[21-22].因此，呼吸鏈中交替呼吸途徑對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的保護(hù)依賴于細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)移過(guò)程.

本研究發(fā)現(xiàn)，WT和dorn-1葉片的光化學(xué)活性對(duì)于SHAM敏感度具有明顯的差異，這說(shuō)明植物也可同時(shí)通過(guò)eATP來(lái)連接線粒體呼吸和光化學(xué)反應(yīng).因目前尚未報(bào)道在植物細(xì)胞的細(xì)胞表面或質(zhì)膜上存在ATP合酶，iATP是植物eATP的唯一來(lái)源[1,3].線粒體呼吸鏈作為ATP合成的主要場(chǎng)所，其正常運(yùn)轉(zhuǎn)是維持iATP產(chǎn)生的重要條件.從理論上講，呼吸鏈的抑制會(huì)導(dǎo)致ATP合成不足，從而影響eATP的水平[23].因此，植物以eATP所介導(dǎo)的線粒體呼吸和光化學(xué)反應(yīng)的聯(lián)系很可能通過(guò)eATP水平的變化來(lái)實(shí)現(xiàn).為進(jìn)一步證明這一猜測(cè)，文中使用外源ATP來(lái)判斷eATP水平的變化是否可以改變呼吸鏈抑制對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加外源ATP后可顯著緩解SHAM所導(dǎo)致的WT葉片Y(Ⅱ)，RET和qp的下降以及Y(NPQ)的上升，而對(duì)SHAM處理后的dorn-1葉片的Y(Ⅱ)，RET，qp，QNP,Y(NPQ)和Y(NO)未有顯著改變.以上結(jié)果表明，呼吸鏈抑制對(duì)植物光化學(xué)過(guò)程的影響的確受到eATP的調(diào)控.而這一調(diào)控作用可能由于呼吸抑制劑通過(guò)影響iATP的產(chǎn)生，繼而改變eATP的水平,從而改變了DORN1對(duì)于植物光化學(xué)反應(yīng)的保護(hù)作用(圖4).我們也注意到，單獨(dú)添加外源ATP對(duì)兩種擬南芥的光化學(xué)效率均無(wú)影響，這可能說(shuō)明正常的eATP水平足以保障DORN1受體對(duì)光合的保護(hù)作用；當(dāng)呼吸鏈抑制導(dǎo)致eATP分泌不足時(shí)，這種保護(hù)作用會(huì)有所下降.綜上所述，交替呼吸途徑抑制對(duì)光合作用的影響很可能與eATP受體蛋白DORN1有關(guān)，且eATP可通過(guò)DORN1對(duì)交替呼吸途徑抑制引起的光化學(xué)活性的下降進(jìn)行調(diào)控.但其具體的保護(hù)機(jī)制尚待進(jìn)一步探索和明確.

圖3 不同處理下dorn-1擬南芥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

圖4 eATP與呼吸鏈對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的影響示意圖

如圖4，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為葉綠體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多還原物質(zhì)(NADPH)通過(guò)蘋果酸-草酰乙酸穿梭途徑由葉綠體轉(zhuǎn)至線粒體，并被交替呼吸途徑以熱的形式耗散，從而保護(hù)了葉綠體的光化學(xué)反應(yīng). 基于本研究的觀察，交替呼吸途徑抑制對(duì)光合作用的影響很可能也與分泌至細(xì)胞外基質(zhì)的eATP水平變化有關(guān)，且eATP 可通過(guò)受體 DORN1 對(duì)交替呼吸途徑抑制引起的光化學(xué)活性的下降進(jìn)行調(diào)控. 因此，植物線粒體可能通過(guò)以上兩種方式對(duì)葉綠體的光化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié).