吳帥帥，武云暉

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2.上海邁景納米科技有限公司，上海 200233）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，癌癥在人類70歲前是死亡的第一或第二原因，其中結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）發(fā)病率居第三位，死亡率居第二位[1-4]。有資料顯示I、Ⅱ期大腸癌患者術(shù)后5年存活率在80%以上，但是晚期大腸癌患者術(shù)后5年存活率只有早期患者的1/5。因此，結(jié)直腸癌發(fā)病早期篩查對降低該疾病的發(fā)病率和死亡率具有重要意義[5-7]。研究顯示，糞便樣本中腸脫落細(xì)胞來源DNA基因甲基化檢測對結(jié)直腸癌患者的檢測靈敏度在90%以上，是進(jìn)行結(jié)直腸癌早期非侵入性篩查的理想方案[8-10]。

由于糞便樣本組分復(fù)雜且個(gè)體差異性大，導(dǎo)致糞便DNA基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差，嚴(yán)重制約了腸脫落細(xì)胞DNA檢測技術(shù)在結(jié)直腸癌輔助診斷、早期篩查的應(yīng)用，也對糞便樣本DNA提取方法提出了更高的要求。

本研究對糞便樣本的DNA提取試劑和流程進(jìn)行了優(yōu)化，通過對糞便樣本的均質(zhì)化處理，以及使用PVP等高分子交聯(lián)劑預(yù)處理去除多糖、膽鹽等生化物質(zhì)，獲得了高人源DNA比例的糞便DNA產(chǎn)物。同時(shí)比較了本方法與商業(yè)化核酸提取試劑盒在提取人源DNA比例上的差異，以及不同方法提取產(chǎn)物對PCR反應(yīng)的抑制性。此外，還對結(jié)直腸癌患者糞便樣本DNA提取產(chǎn)物和癌組織樣本DNA提取產(chǎn)物的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化測序（BSP）[11]結(jié)果進(jìn)行了比對。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

糞便樣本來源于接受體檢的正常受試者和經(jīng)病理檢查確診的結(jié)直腸癌患者，所有受試者采集樣本前均已簽署知情同意書。結(jié)直腸癌患者同時(shí)采集癌組織樣本置于-80 ℃凍存。

1.2 儀器與試劑

Light Cycler 480Ⅱ PCR儀，羅氏公司；Nanodrop one超微量紫外分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

Taqman Universal Master MixⅡ with UNG，Thermo Fisher Scientific；EZ DNA Methylation-Lightning Kit，ZYMO RESEARCH；組織基因組DNA提取試劑盒，TIANGEN；糞便基因組DNA快速提取試劑盒，Bioteke；糞便基因組DNA提取試劑盒，ZYMO RESEARCH。

1.3 糞便樣本預(yù)處理、糞便DNA和組織DNA提取

（1）糞便樣本預(yù)處理：糞便樣本先經(jīng)過均質(zhì)化處理（采用高速研磨均質(zhì)或顛倒混勻方式），將處理后的糞便上清置于-20 ℃冰箱預(yù)冷1 h，13 000×g離心3 min后吸取中間層上清液。向上清中加入4%的PVP交聯(lián)劑后顛倒混勻，13 000×g離心3 min后棄去沉淀，上清液用于核酸提取。

（2）糞便DNA提取：取800 μL預(yù)處理后的糞便上清液加入裂解管中，震蕩混勻后離心，轉(zhuǎn)移全部上清后加入蛋白酶K和裂解液，70 ℃溫育10 min，然后加入核酸結(jié)合液和氧化硅磁珠混勻2 min后棄去上清，加入500 μL洗滌液A和洗滌液B洗滌2次，最后使用100 μL的Low TE緩沖液從磁珠上洗脫吸附的DNA，-20 ℃條件下保存待用。

糞便DNA提取對比方法分別使用基于柱法提?。╖YMO REASARCH，D6010）和基于磁珠法提取的通用性核酸提取試劑盒（Bioteke，AU46212），所有操作均按照廠家提供的說明要求進(jìn)行。

（3）組織DNA提?。菏褂媒M織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN），按照試劑盒說明書，取10 mg組織樣本研磨勻漿后，加入蛋白酶K，在56 ℃溫育10 min充分消化蛋白，然后分別加入裂解液和結(jié)合液處理，加入DNA洗滌液1和DNA洗滌液2去除試劑殘留，最后使用Low TE緩沖液洗脫DNA。洗脫產(chǎn)物置于4 ℃短時(shí)保存或置于-20 ℃條件下保存待用。

1.4 DNA提取產(chǎn)物純度和濃度檢測

使用紫外分光光度計(jì)測定不同方法提取得到的糞便DNA和組織DNA產(chǎn)物濃度和純度，分別以O(shè)D260/OD280和OD260/OD230表示。

1.5 糞便DNA中人源基因組DNA的定量（qPCR法）

選擇管家基因β-Actin對糞便DNA中人基因組DNA進(jìn)行定量分析。PCR引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

正向引物序列：5′-TGGAGGAGGCTCAGCAAGTC-3′，反向引物序列：5′-CCACCACCCAGCACACAGT-3′，探針：5′VIC-TCTGGACTGTGAACCTG-3′MGB。

熒光定量PCR體系為20 μL，包括4 μL糞便DNA模 板，1×Taq PCR buffer，2 mmol/L的 MgCl2，300 mmol/L的 dNTPs，1 U 的 Taq DNA Polymerase，200 nmol/L的上下游引物、探針。

人源基因組DNA定量的PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 30 s，65 ℃ 30s（VIC通道采集熒光信號），共50個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后使用Light Cycler 480 Ⅱ儀器配套分析軟件對采集的熒光信號進(jìn)行分析，根據(jù)Cp值計(jì)算糞便DNA中人基因組DNA的含量。

1.6 糞便和組織樣本甲基化特征的BSP驗(yàn)證

按照EZ DNA Methylation-Lightning Kit試劑盒說明書要求，取500 ng或不大于20 μL糞便DNA（組織DNA）轉(zhuǎn)化模板。按照試劑盒說明書轉(zhuǎn)化完成后使用15 μL M-Elution Buffer洗脫轉(zhuǎn)化后模板DNA。

BSP正向引物序列：5′-TGTAGGAGAAGTYGGGTTGG-3′，反向引物序列：5′-AACTTTTCRAAACCCCRAAT-3′。

取4 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入甲基化測序PCR擴(kuò)增體系：1×Taq PCR buffer，2 mmol/L的MgCl2，300 mmol/L的 dNTPs，1 U 的 Taq DNA Polymerase，200 nmol/L的上下游引物、探針。

BSP的PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，65 ℃ 30s（-0.5 ℃ /循環(huán)），72℃ 20 s，然后再使用55 ℃退火條件擴(kuò)增40循環(huán)，富集靶區(qū)域產(chǎn)物。PCR程序結(jié)束后將產(chǎn)物置于-20 ℃條件保存并外送測序公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞便DNA中人基因組DNA定量

2.1.1 用于糞便樣本中人ACTB基因定量的方法建立

本研究通過熒光定量PCR分析管家基因ACTB的含量，建立了分析糞便DNA中人源DNA的含量方法，結(jié)果如圖1所示。圖1A是10 000、5 000、1 000、200和100拷貝的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)PCR擴(kuò)增曲線；圖1B表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.008 7X+29.7600，本方法用于ACTB基因定量分析準(zhǔn)確性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.99。

圖1 ACTB基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR體系

2.1.2 不同均質(zhì)化方法對人基因組DNA提取效率影響

對研磨均質(zhì)與顛倒混勻均質(zhì)處理后提取的糞便總DNA產(chǎn)率和人基因組DNA產(chǎn)率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：研磨均質(zhì)較顛倒混勻方式可以更充分地釋放微生物DNA，研磨均質(zhì)可以得到比顛倒混勻均質(zhì)約3倍量的糞便總DNA；但是通過qPCR定量分析人基因組含量發(fā)現(xiàn)，研磨均質(zhì)與顛倒混勻均質(zhì)得到的人基因組DNA含量無顯著差異，兩者基本一致（圖2A）。通過人基因組DNA含量及糞便總DNA含量分析計(jì)算可知：兩種均質(zhì)處理方式中，顛倒混勻均質(zhì)處理得到的糞便總DNA中人基因組DNA比例更高，微生物DNA背景更少，更適用于基于糞便樣本的人基因組DNA基因檢測分析（圖2B）。

圖2 不同均質(zhì)方法對糞便總DNA及人基因組DNA提取效率影響

2.2 糞便上清預(yù)處理對PCR抑制物去除效果的影響

對6例糞便樣本3平行重復(fù)處理后提取糞便DNA，然后通過qPCR定量分析人β-Actin基因組含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過PVP預(yù)處理的糞便DNA均能有效擴(kuò)增（Cp均值為20.53），且Cp值較未經(jīng)PVP處理的糞便DNA擴(kuò)增均值（Cp均值為21.69）明顯減?。≒＜0.01），未經(jīng)預(yù)處理的糞便上清中有10個(gè)樣品糞便DNA因PCR抑制干擾沒有擴(kuò)增信號（圖3B）。因此，通過PVP溶液預(yù)處理上清可以獲得純度更高、潛在PCR抑制成分更少的糞便DNA。

圖3 預(yù)處理措施對提取糞便DNA濃度和PCR抑制效果的影響

2.3 不同提取方法對人基因組DNA提取富集效率評價(jià)

通過比較不同糞便DNA提取方法提取的糞便DNA中人基因組DNA占總糞便DNA的比例評價(jià)糞便樣本中人基因組DNA提取富集效率差異。使用4例來自不同個(gè)體的糞便樣本，每份樣本平均分成3份分別使用本研究優(yōu)化提取方案、糞便基因組DNA快速提取試劑盒（Bioteke）、糞便基因組DNA提取試劑盒（ZYMO RESEARCH）進(jìn)行糞便DNA提取，結(jié)果如圖4所示。研究結(jié)果表明，商業(yè)化試劑盒柱法和磁珠法提取的糞便DNA中人基因組DNA比例基本一致，約占0.5%；本研究優(yōu)化提取方案提取產(chǎn)物中人基因組DNA占比達(dá)6.62%；不同提取方法對糞便樣本中人基因組DNA的相對富集作用差異顯著（P≤0.01）。

圖4 3種提取方法糞便DNA產(chǎn)物中人基因組DNA的比例

2.4 結(jié)直腸癌患者糞便和組織樣本BSP結(jié)果比較

為進(jìn)一步探索本研究中糞便DNA提取方案對臨床樣本的有效性，采用BSP方法繼續(xù)測試了4例健康志愿者糞便樣本和4例結(jié)直腸癌患者糞便樣本和組織樣本中靶基因甲基化結(jié)果。糞便樣本DNA提取均采用本研究優(yōu)化的人基因組DNA富集提取方案，一代測序服務(wù)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

BSP測序結(jié)果顯示：在4例結(jié)直腸癌患者糞便樣本和組織樣本平行比較中，有3例糞便DNA檢測結(jié)果為陽性，1例為陰性（圖5），糞便樣本測序結(jié)果和對應(yīng)組織樣本測序結(jié)果完全一致；4例健康志愿者糞便樣本測序結(jié)果3例陰性，1例陽性（圖6）；8例糞便樣本DNA均測序成功且測序結(jié)果和組織DNA測序結(jié)果一致，在臨床樣本中應(yīng)用效果良好。

圖5 4例結(jié)直腸癌患者糞便樣本和組織樣本平行比較BSP測序結(jié)果

圖6 4例健康志愿者糞便樣本BSP測序結(jié)果。

3 結(jié)論

得益于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，結(jié)直腸癌早診、早治在降低癌癥發(fā)病率和死亡率方面發(fā)揮著越來越重要的作用。結(jié)直腸癌患者基于糞便DNA的腫瘤生物標(biāo)志物檢測較FOBT、血清學(xué)檢測等方法具有更高的靈敏度和特異性，但是糞便樣本因成分復(fù)雜，簡單高效制備高人源DNA比例、低PCR抑制性的產(chǎn)物還面臨很多難題。本研究方案實(shí)現(xiàn)了人源DNA的相對富集提取，提取試劑可以有效去除糞便樣本中的雜質(zhì)成分，提高糞便DNA產(chǎn)物下游PCR檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，在結(jié)直腸癌早期篩查領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。