從叢，魏霞臻

（1.長(zhǎng)安大學(xué)醫(yī)院，陜西西安 710064；2.西安交通大學(xué)陜西天奎生物醫(yī)藥科技有限公司，陜西西安 710061）

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征是一類(lèi)病因尚未完全清楚而又有相同或相似臨床癥狀的一組疾病的總稱(chēng)，可伴有顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)疼痛、下頜運(yùn)動(dòng)異常、關(guān)節(jié)彈響及功能性障礙等癥狀[1]。研究證實(shí)，顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨是雌激素作用的靶組織，雌激素在顳下頜關(guān)節(jié)的生長(zhǎng)發(fā)育及顳下頜關(guān)節(jié)紊亂的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥可以造成顳下頜關(guān)節(jié)骨退行性病變[2-4]。

本研究中的試驗(yàn)藥品SXZG藥物是以沙棘油脂肪酸為主成分的中藥組方制備成的中藥軟膠囊劑，其主要成分含十六碳酸、十六碳烯酸、十八碳一烯酸、十八碳二烯酸、十八烷酸等飽和/不飽和脂肪酸。前期研究證實(shí)SXZG藥物可以降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病概率，但是其對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)髁突有何影響目前還沒(méi)有研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立SD大鼠骨質(zhì)疏松模型，制作大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突部免疫組化染色切片來(lái)觀察SXZG藥物對(duì)髁突中骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）及骨保護(hù)素配體（Osteoprotegerin Ligand，OPGL）表達(dá)的影響，初步研究SXZG藥物對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠顳下頜關(guān)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD雌性大鼠70只，其中8月齡60只，3月齡10只，購(gòu)自北京醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0004]，質(zhì)量 290±20 g。

1.2 材料與試劑

SXZG，批號(hào)20110312，西安交通大學(xué)天奎生物醫(yī)藥科技有限公司；己烯雌酚，批號(hào)20100920，合肥久連制藥有限公司；仙靈骨葆膠囊，批號(hào)110784，貴州同濟(jì)堂制藥有限公司；OPG多克隆抗體及OPGL多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒，上海科興生物科技有限公司；2%戊巴比妥鈉，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；4%甲醛，天津市大茂化學(xué)制劑廠；EDTA，0.5 mol/L，廣州化學(xué)試劑廠；二甲苯，天津市大茂化學(xué)制劑廠；PBS，0.01 mol/L，上?；瘜W(xué)試劑三廠；枸櫞酸鈉緩沖液，0.01 mol/L，天津市大茂化學(xué)制劑廠；3%過(guò)氧化氫，廣州化學(xué)試劑廠；山羊血清，北京中杉金橋有限公司；蘇木素，北京化學(xué)試劑公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HHWCu600型恒溫水浴箱，上海醫(yī)療器械廠；S-WSH型超純水儀，美國(guó)Millipore；SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica；QDR—4500A型骨密度測(cè)定儀，美國(guó)HOLOGIC。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建模實(shí)驗(yàn)

在60只8月齡SD大鼠中隨機(jī)選取50只，將2%戊巴比妥鈉以40 mg/kg的劑量注射入大鼠腹腔進(jìn)行全麻，置于俯臥位固定，在背部1/3處剪毛備皮，沿背部正中線向下作一個(gè)縱形切口，切開(kāi)皮膚及皮下組織，沿肩胛分別于左右兩脅下剪開(kāi)腰肌，暴露出卵巢及子宮角，將雙側(cè)卵巢完整摘除，術(shù)后分層縫合肌肉及皮膚。剩余10只8月齡SD大鼠作為假手術(shù)組，全麻后打開(kāi)腹腔，暴露子宮與卵巢，但并未將其切除，直接縫合。手術(shù)3個(gè)月后，在50只去勢(shì)大鼠中隨機(jī)抽取10只，與假手術(shù)組的10只大鼠比較，用骨密度測(cè)定儀檢測(cè)大鼠腰椎、脛骨、股骨的骨密度，檢測(cè)結(jié)果顯示去勢(shì)大鼠腰椎、脛骨、股骨三個(gè)部位的骨密度均較假手術(shù)組下降（P＜0.05），說(shuō)明骨質(zhì)疏松模型建模成功。

1.4.2 分組及給藥

建模成功后，將50只去勢(shì)大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，灌服不同的藥物，即SXZG劑量1組、SXZG劑量2組、己烯雌酚片組（陽(yáng)性對(duì)照）、仙靈骨葆膠囊組（陽(yáng)性對(duì)照）和空白乳劑組；另外2組為假手術(shù)組和青年對(duì)照組（3月齡大鼠），喂服空白乳劑。大鼠連續(xù)灌藥3個(gè)月后，按組別處死，解剖分離出下頜骨。

1.4.3 制作免疫組化染色切片

將大鼠下頜骨置于4%甲醛中固定一周，固定后將下頜骨放入EDTA脫鈣液中充分脫鈣8周，包埋，將髁突區(qū)域石蠟包塊用切片機(jī)制作4～5 μm厚的切片，68 ℃烤片20 min后二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS沖洗5 min×3次；枸櫞酸鈉緩沖液中微波爐內(nèi)加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗5 min×3次；3%過(guò)氧化氫37 ℃孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；吸水紙吸去切片上多余的水分，滴加正常山羊血清進(jìn)行封閉，室溫孵育10 min。傾去切片上的血清，滴加一抗（兔抗鼠）工作液，4 ℃過(guò)夜；室溫下復(fù)溫30 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加二抗（羊抗兔）工作液，37 ℃孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；DAB顯示劑顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，之后自來(lái)水充分沖洗，蘇木素進(jìn)行復(fù)染，梯度酒精脫水后，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用激光掃描共聚焦顯微鏡給所有免疫組化切片照相，每個(gè)切片取3個(gè)視野。OPG和OPGL免疫組化結(jié)果以胞漿呈棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)，利用MOTIC Med 6.0數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)視野的免疫組化染色灰度值，計(jì)算出平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 下頜骨髁突免疫組化染色觀察

顯微鏡下可見(jiàn)OPG及OPGL在大鼠髁突軟骨的全層均可表達(dá)，在軟骨下骨組織中的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及骨小梁邊緣的骨細(xì)胞中有不同程度表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠髁突中OPG和OPGL的表達(dá)

2.2 各組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突中OPG及OPGL表達(dá)灰度值比較

計(jì)算髁突中OPG及OPGL免疫組化染色灰度值，其數(shù)值越大，表示細(xì)胞因子表達(dá)的量越小。與假手術(shù)組相比，去勢(shì)組大鼠髁突中OPG表達(dá)明顯減少（P＜0.05），而OPGL的表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；SXZG劑量1組、SXZG劑量2組大鼠髁突中OPG的表達(dá)均較去勢(shì)組增多（P＜0.05），OPGL陽(yáng)性表達(dá)均較去勢(shì)組減少；SXZG劑量1組、SXZG劑量2組與假手術(shù)組相比，髁突中OPG的陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），OPGL表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；己烯雌酚片組及仙靈骨葆膠囊組大鼠髁突中OPG表達(dá)均較去勢(shì)組增加（P＜0.05），OPGL的表達(dá)較去勢(shì)組降低（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠髁突OPG及OPGL表達(dá)灰度值比較

在口腔臨床中，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征是一種較為常見(jiàn)的疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂、骨關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎及周?chē)浗M織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與絕經(jīng)期女性體內(nèi)雌激素水平下降有關(guān)，雌激素的缺乏可導(dǎo)致絕經(jīng)期婦女骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[5]。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病屬于顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征（Temporomandibular Disorders，TMD）分類(lèi)中的常見(jiàn)類(lèi)型，是一種非感染性、非炎癥性的退行性關(guān)節(jié)病變[6]。雌激素對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞有一定調(diào)節(jié)作用，絕經(jīng)后婦女由于雌激素水平降低導(dǎo)致骨形成速率降低，使骨吸收高于骨形成，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[7]。然而，在骨質(zhì)疏松的進(jìn)展過(guò)程中，如何防止髁突軟骨及軟骨下骨組織隨之發(fā)生改變，目前國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少[8]。

OPG-OPGL-RANK（核因子-κB受體活化因子，Receptor Activator of NF-κB）系統(tǒng)是聯(lián)系軟骨與軟骨下骨的一條重要路徑，OPG與OPGL的比例對(duì)軟骨下骨組織的重建起到?jīng)Q定性作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞可分泌OPG與OPGL，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨組織中均有OPG與OPGL的表達(dá)，與骨關(guān)節(jié)炎的形成及關(guān)節(jié)旁骨丟失密切相關(guān)[10]。目前認(rèn)為OPG是抑制破骨細(xì)胞最有效的細(xì)胞因子，其對(duì)破骨細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)在可抑制破骨細(xì)胞的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，使得真正具有溶骨功能的破骨細(xì)胞數(shù)量減少，從而達(dá)到保護(hù)骨組織的作用。實(shí)驗(yàn)顯示，OPG可以增加骨密度及骨小梁數(shù)目，控制鈣的吸收，還可以通過(guò)抑制破骨細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成來(lái)抑制骨吸收[11]。有學(xué)者認(rèn)為，OPGL是唯一能直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育并使破骨細(xì)胞激活且可以抑制破骨細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子[12]。骨組織中OPGL的受體為RANK，主要表達(dá)在破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上，OPGL可通過(guò)與RANK的結(jié)合來(lái)激活NF-κB和c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal Protein Kinase，JNK），從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，增加成熟破骨細(xì)胞的活性，阻止破骨細(xì)胞的凋亡，但OPGL的上述作用可被OPG競(jìng)爭(zhēng)性地抑制，因?yàn)镺PG能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合OPGL或阻斷OPGL與RANK的結(jié)合[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，去勢(shì)組大鼠在切除卵巢后，下頜骨髁突中OPG表達(dá)明顯減少，而OPGL表達(dá)明顯增多，說(shuō)明大鼠摘除卵巢后，髁突骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)，而骨形成減弱；在經(jīng)SXZG治療后，大鼠下頜骨髁突中OPG陽(yáng)性表達(dá)較去勢(shì)組增多，而OPGL陽(yáng)性表達(dá)較去勢(shì)組減少，說(shuō)明SXZG可以增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠髁突的成骨作用，并抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠髁突骨組織的骨吸收活動(dòng)。

3 結(jié)論

通過(guò)摘除大鼠卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，將造模成功的雌性SD大鼠采用不同藥物灌胃治療后發(fā)現(xiàn)，SXZG可通過(guò)調(diào)節(jié)髁突中成骨細(xì)胞因子OPG及破骨細(xì)胞因子OPGL表達(dá)的比例來(lái)影響顳下頜關(guān)節(jié)髁突的骨代謝，從而改善去卵巢大鼠因雌激素水平下降導(dǎo)致的髁突部骨組織丟失。