尹京偉，寧周神，巢志英，金志興，董偉

（江西理工大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，江西贛州 341000）

稀土素有“工業(yè)黃金”的美譽(yù)，被廣泛應(yīng)用于智能陶瓷、軍事設(shè)備等領(lǐng)域[1]，可以提升金屬材料的性能以及農(nóng)作物的產(chǎn)量等。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展及社會(huì)的不斷進(jìn)步，全球?qū)ο⊥恋男枨罅坎粩嗵嵘?。我?guó)作為稀土資源大國(guó)，對(duì)稀土的開(kāi)采規(guī)模不斷擴(kuò)大，盡管隨著經(jīng)驗(yàn)的積累和科技的進(jìn)步，采用的多種工藝流程和提取方法有了一定的提升，但依舊存在缺陷。而稀土的大量開(kāi)采導(dǎo)致的土壤及地下水的污染[2-3]、山體滑坡、土壤酸化、植物破壞和生活環(huán)境的破壞[3]等問(wèn)題也日益嚴(yán)峻。

前期研究表明，芽孢桿菌等菌株具有根際促生及稀土離子吸附等功能，在微生物修復(fù)污染礦山土壤中發(fā)揮重要作用[4-5]。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行稀土離子脅迫耐受性研究，以期搞清枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特性，為其在離子型稀土礦山土壤修復(fù)的實(shí)踐應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌菌種由美國(guó)微生物科學(xué)院院士Peter Setlow（美國(guó)康涅狄格大學(xué)醫(yī)學(xué)院，UConn Health）提供，在本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑與儀器

氯化鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硝酸鋱六水化合物，分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；2,6-吡啶二羧酸，分析純，上海九鼎化學(xué)科技有限公司；HEPES，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

YXQ-75SII型滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV755B型紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；SuPerMax300型多功能酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；NCY-E200型相差顯微鏡，尼康儀器（上海）有限公司；JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；3H16RI型智能高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；HZQ-F400型立體式震蕩培養(yǎng)箱，常州智博瑞儀器制造有限公司；TOMG-10C型微電腦生化培養(yǎng)箱，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 培養(yǎng)基配方

LB液體培養(yǎng)基（1 L）：10 g氯化鈉、10 g蛋白胨、5 g酵母浸粉，調(diào)pH至7.0左右。LB固體培養(yǎng)基額外添加18～20 g瓊脂。

2×SG固體培養(yǎng)基配方：970 mL去離子水中加入營(yíng)養(yǎng)肉湯16 g，1 mol/L MgSO4溶液2 mL，2 mol/L氯 化 鉀 溶 液 13 mL，1 mol/L MnCl2溶 液 100 μL，0.036 mol/L FeSO4溶液 30 μL，瓊脂粉 15 g，定容到1 L，高壓滅菌，滅菌后加入單獨(dú)滅菌的20 mL 50×硝酸鈣·葡萄糖溶液。

1.4 芽孢的制備

1.4.1 菌種活化與培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)過(guò)夜后得到活化菌株?；罨玫木N接入LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、250 r/min培養(yǎng)5 h得到菌液。取100 μL上述菌液于2×SG固體培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.4.2 芽孢制備

將培養(yǎng)基上的菌體收集至離心管，于4 ℃、8 000r/min離心10 min后除去雜質(zhì)，用無(wú)菌水懸浮菌液，超聲破碎6 min后離心除去細(xì)胞破碎物，反復(fù)多次，直至相差顯微鏡下觀察到95%的菌體為明亮菌體，說(shuō)明芽孢純化完成。將制備好的芽孢放入4 ℃冰箱保存。

1.5 芽孢萌發(fā)測(cè)定

1.5.1 芽孢液體培養(yǎng)基萌發(fā)

取兩EP管中的芽孢于15 mL離心管中，取一定量稀釋一定倍數(shù)（設(shè)為X），測(cè)定溶液在600 nm處吸光度A（0.3～0.8），得到芽孢母液的OD濃度A0=A×X。

LB液體培養(yǎng)基中加入離心后的芽孢稀釋液，于37 ℃、200 r/min下測(cè)定600 nm下未加芽孢和加芽孢后培養(yǎng)基吸光度，每5 min測(cè)量并記錄1次數(shù)據(jù)。

以硝酸鋱六水合物為原料制備10 mmol/L的Tb3+母液，配制不同濃度Tb3+（0 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L和1 000 μmol/L）的LB液體培養(yǎng)基的各50 mL，高壓蒸汽滅菌后待用。

取OD值接近0.8的芽孢稀釋液，離心后加入溶液中，每隔5 min測(cè)定并記錄加入芽孢后培養(yǎng)基在600 nm下的吸光度。

1.5.2 芽孢萌發(fā)劑激活萌發(fā)

通過(guò)稀釋一定倍數(shù)（X）后測(cè)得OD600A1為0.3～0.8，計(jì)算出芽孢母液的OD600A=X×A1，將芽孢母液稀釋[(X×A1)/2]倍后得到OD600為2的芽孢母液。向酶標(biāo)板孔中依次加入20 μL HEPES緩沖液和無(wú)菌水（作為補(bǔ)充），再各加100 μL OD600為2.0的芽孢母液，然后添加不同量的Tb3+母液（10 mmol/L），最后再各加入20 μL的纈氨酸（0.1 g/L）。在熒光激發(fā)波長(zhǎng)為275 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為545 nm下每隔2 min測(cè)定酶標(biāo)板內(nèi)混合溶液的熒光強(qiáng)度[6]。

1.6 芽孢桿菌的耐脅迫實(shí)驗(yàn)

1.6.1 芽孢桿菌母液

對(duì)活化的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)：用LB液體培養(yǎng)基在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h后獲得枯草芽孢桿菌母液[8]。

1.6.2 加入菌后測(cè)定

制備含有不同濃度的Tb3（+0 μmol/L、600 μmol/L、1 200 μmol/L、1 800 μmol/L 和 2 400 μmol/L）的培養(yǎng)基各50 mL。在上述培養(yǎng)基中加1 mL芽孢桿菌母液，在37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)。每隔1 h對(duì)加入菌液前后的培養(yǎng)基進(jìn)行OD600連續(xù)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋱離子對(duì)芽孢萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響

芽孢在含不同濃度鋱離子的LB培養(yǎng)液中的萌發(fā)情況如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，LB能夠刺激芽孢萌發(fā)，當(dāng)培養(yǎng)30～40 min后芽孢OD值降至原來(lái)的50%左右，此時(shí)芽孢全部萌發(fā)（相差顯微鏡下觀察，芽孢已由明亮變?yōu)榛液冢?。之后的時(shí)間OD值慢慢升高，芽孢經(jīng)歷長(zhǎng)出過(guò)程，直至形成細(xì)胞，并進(jìn)行繁殖。

圖1 枯草芽孢桿菌芽孢在LB培養(yǎng)液中的萌發(fā)曲線

圖2 不同濃度鋱離子對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)影響

如圖2所示，在低濃度的鋱離子溶液中芽孢萌發(fā)基本相似，以0 μmol/L的Tb3+的實(shí)驗(yàn)為對(duì)照，可以看到1 000 μmol/L Tb3+會(huì)抑制芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)，且抑制強(qiáng)度隨著Tb3+濃度的升高而增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)受稀土離子的濃度影響較小，對(duì)稀土離子耐受性較強(qiáng)，離子型稀土礦山廢水中的稀土離子濃度對(duì)于芽孢來(lái)說(shuō)還在耐受范圍之內(nèi)。然而，濃度過(guò)高的Tb3+會(huì)抑制芽孢桿菌芽孢的萌發(fā)，抑制效果的強(qiáng)弱可以通過(guò)600 nm下達(dá)到最低吸光度的時(shí)間不同來(lái)表現(xiàn)（OD600的拐點(diǎn)表示芽孢全部萌發(fā)的時(shí)間點(diǎn)），時(shí)間越長(zhǎng)則該濃度Tb3+的抑制效果越強(qiáng)，反之則抑制效果越弱。

2.2 芽孢萌發(fā)劑激活的萌發(fā)動(dòng)力學(xué)

如圖3所示，以纈氨酸為萌發(fā)劑，通過(guò)添加不同劑量的鋱離子研究它對(duì)芽孢萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，高濃度Tb3+抑制芽孢萌發(fā)，熒光強(qiáng)度的高低與結(jié)合物的量在一定范圍內(nèi)成正比。添加500 μmol/L鋱離子測(cè)得的熒光強(qiáng)度比1 000 μmol/L的高，說(shuō)明高于500 μmol/L的Tb3+會(huì)抑制芽孢的萌發(fā)。而比較500 μmol/L與200 μmol/L的Tb3+添加量發(fā)現(xiàn)，在200 μmol/L下Tb3+濃度未達(dá)到飽和，Tb3+飽和濃度應(yīng)在200～1 000 μmol/L。

圖3 鋱離子對(duì)纈氨酸激活的芽孢萌發(fā)動(dòng)力學(xué)影響

2.3 芽孢桿菌對(duì)鋱離子的耐受性

不同鋱離子濃度對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響如圖4所示。結(jié)果表明，在一定Tb3+濃度范圍內(nèi)，Tb3+的濃度越高對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用越強(qiáng)。枯草芽孢桿菌的半致死Tb3+濃度大于2 400 μmol/L。

圖4 鋱離子對(duì)枯草芽孢桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

Tb3+濃度在500～1 000 μmol/L時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)及該菌的生長(zhǎng)都有抑制作用，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。本研究結(jié)果與前期研究一致，即Tb3+濃度對(duì)芽孢桿菌芽孢萌發(fā)、細(xì)胞生長(zhǎng)都有影響[9-11]。

3 結(jié)論

本文研究了稀土離子鋱對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)、生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)存在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的現(xiàn)象。而對(duì)于離子型稀土礦山廢水中的Tb3+來(lái)說(shuō)，實(shí)際濃度遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)用的抑制濃度，很可能對(duì)枯草芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)以及生長(zhǎng)有促進(jìn)或者只有較弱的抑制效果。

因此，未來(lái)的研究方向主要為：（1）微生物與植物的聯(lián)合修復(fù)研究，特別是根際促生菌的篩選利用以及利用轉(zhuǎn)基因、基因編輯技術(shù)定向改造微生物以適用于治理離子型稀土礦山；（2）利用多種微生物聯(lián)合吸附與回收稀土離子，從而減少稀土離子的流失和對(duì)礦山生態(tài)環(huán)境的破壞，實(shí)現(xiàn)離子型稀土資源綠色開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。