梁翔宇，顧 欣，劉文輝，孫小涵，白宇馨，馬 艷，李 茜，趙 瑩

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

鹽堿化是全球耕地土壤面臨的重要問(wèn)題之一[1]。為了利用鹽堿化耕地并減少土壤鹽堿化程度，人們采用了許多土壤改良方法。其中，生物措施被認(rèn)為是較為有效且環(huán)境友好的措施[2]。例如，使用生物有機(jī)肥可顯著改善鹽堿地的土壤性質(zhì)[3]，施用菌劑可以促進(jìn)作物在鹽堿化土壤中生長(zhǎng)等[4—5]，生物有機(jī)肥和菌劑中的耐鹽堿有益功能菌發(fā)揮了重要作用[6]。因此，分離獲得耐鹽堿性良好、可促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能微生物對(duì)鹽堿地改良及新型菌劑的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）是指存在于植物根際周?chē)囊活?lèi)可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)，提高植株抗病性的微生物[7]。其對(duì)植物生長(zhǎng)和土壤改良均具有重要作用[8]。針對(duì)鹽堿地植物生長(zhǎng)和土壤改良需求，耐鹽堿的PGPR逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究者利用三級(jí)篩選體系從新疆堿蓬（Suaeda glauca）根際土壤中分離獲得PGPR菌，包括芽孢桿菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、鹽芽孢桿菌（Halobacillus sp.）、腸桿菌（Enterobacter sp.）和節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）[9]；從濱海鹽堿地的非鹽生植物根際土壤中篩選獲得了耐鹽促生芽孢桿菌B.megaterium T1-8菌株和B.paraflexus T4-9菌株[10]；從新疆鹽爪爪（Kalidium foliatum）根際土壤中分離獲得了57株細(xì)菌，分屬4個(gè)門(mén)12個(gè)屬，且多數(shù)菌株兼有耐鹽和促生作用[11]。以上研究說(shuō)明，鹽堿地土壤中具有豐富的PGPR資源，有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

銀川平原位于我國(guó)西北部，由于氣候、地質(zhì)和人為干擾等原因，土壤易發(fā)生鹽堿化[12]。因此，當(dāng)?shù)貙?duì)耐鹽堿PGPR資源的開(kāi)發(fā)和利用存在需求。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集寧夏銀北鹽堿地鹽生植物根際土壤，利用選擇培養(yǎng)法分離篩選耐鹽堿的根際促生細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定，并檢測(cè)其促生作用和鹽堿耐受性，期望為有益功能菌的開(kāi)發(fā)利用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集2019年10月，選擇寧夏銀北地區(qū)平羅縣西大灘和惠農(nóng)區(qū)禮和鄉(xiāng)2個(gè)鹽堿地區(qū)，以堿蓬、鹽爪爪和蘆葦（Phragmites communis）為優(yōu)勢(shì)種的區(qū)域，挖取植株，盡量保留根系和根際土壤，裝于密封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。利用抖根法采集植物根際土壤，用于目標(biāo)微生物的分離篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[13]、阿須貝培養(yǎng)基[14]、解磷菌篩選培養(yǎng)基[15]、解鉀菌篩選培養(yǎng)基[16]、LB培養(yǎng)基[17]、CAS培養(yǎng)基[18]。

1.1.3 主要儀器超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（ZD-85，江蘇金壇市醫(yī)療器械廠）；恒溫生化培養(yǎng)箱（LRH-250；上海一恒科技有限公司）；顯微鏡（BME，徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司）；高壓滅菌鍋（MLS-3750，SANYO）；電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺（LINKS，II型，0～150 mm）；火焰光度計(jì)；分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化稱(chēng)取植物根際土壤5 g，置于無(wú)菌水95 mL中，于180 r/min、28℃下?lián)u勻30 min，將土壤懸液按梯度進(jìn)行稀釋后，分別取10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液各100μL，采用稀釋涂布平板法涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。挑取細(xì)菌單菌落，經(jīng)3次劃線純化獲得純培養(yǎng)，接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，作為菌種置于4℃冷藏箱中備用。

1.2.2 耐鹽根際促生菌的分離篩選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于28℃活化菌株24 h，轉(zhuǎn)接至阿須貝培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)。定期觀察菌株生長(zhǎng)情況，以“+”代表菌株在平板上長(zhǎng)出菌落，以示其具有固氮能力。從劃線第2天開(kāi)始，如果長(zhǎng)出菌落記為“+++++”，每延遲1天長(zhǎng)出菌落減少1個(gè)“+”，連續(xù)觀察至第7天，未生長(zhǎng)的菌株記為“-”。

將活化后的菌株點(diǎn)接于CAS平板上，每板3個(gè)點(diǎn)，每株菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，于28℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄有無(wú)橙色暈圈，測(cè)量單菌落橙色暈圈直徑（D）和菌落直徑（d），每個(gè)暈圈和菌落直徑各測(cè)量3次取平均值，計(jì)算D/d比值。D/d比值小于1記“+”；D/d比值大于1且小于1.5記“++”；D/d比值大于1.5記“+++”?！?”越多代表菌株具有越強(qiáng)的產(chǎn)鐵載體能力，而菌株周?chē)串a(chǎn)生橙色暈圈的菌株，即不產(chǎn)鐵載體，記為“-”。

菌株的解磷量采用鉬銻抗比色法[19]、解鉀量采用火焰光度法[20]、IAA產(chǎn)量采用Salkowski比色法[21]、ACC脫氨酶活性采用α-酮丁酸法[22]測(cè)定。

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加NaCl使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%，6%，7%，8%，9%，共設(shè)5個(gè)梯度，制成鹽平板。將活化后的菌株依次點(diǎn)接到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽平板上，每株菌設(shè)置3個(gè)平板重復(fù)，于28℃培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑。每個(gè)菌落直徑測(cè)量3次，取平均值。菌株能生長(zhǎng)的最高鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為該菌株的NaCl耐受值。同理，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH值，設(shè)pH=6、7、8、9、10共5個(gè)梯度，制成酸堿度平板，依次點(diǎn)接供試菌株到不同pH值的酸堿度平板上，每株菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，于28℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量菌落直徑。菌株能生長(zhǎng)的最高pH值為該菌株的pH耐受值。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和分析采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析，采用LSD法在P＜0.05水平上檢測(cè)差異性。DNA序列同源性比較使用NCBI系統(tǒng)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建采用Mega-X軟件。

1.2.4 耐鹽促生菌的分類(lèi)鑒定參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[23]，對(duì)目標(biāo)菌株開(kāi)展形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定?；罨辏崛』蚪MDNA，對(duì)細(xì)菌的16 SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳和回收[24]，委托北京奧維森基因科技公司完成測(cè)序。將得到的測(cè)序結(jié)果提交至Genbank獲得序列號(hào)，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，依據(jù)對(duì)比信息對(duì)菌株進(jìn)行分析鑒定。在數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇相近種屬的基因序列，使用Mega-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，初步確定菌株的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的促生活性

共分離獲得細(xì)菌83株，其中具有固氮作用的菌株有23株，具有解磷作用的菌株19株，具有解鉀作用的菌株14株，具有產(chǎn)IAA能力的菌株15株，具有產(chǎn)鐵載體能力的菌株11株，具有ACC脫氨酶活性的菌株10株。其中菌株P(guān)J10、PL11、HL3、HJ9和HY5具有2種以上的促生功能，且促生活性較強(qiáng)，如表1所示。經(jīng)過(guò)比較可知，菌株P(guān)J10具有較強(qiáng)的解磷活性，無(wú)機(jī)磷解磷量為（44.10±0.12）mg/L；菌株P(guān)L11和HJ9具有較強(qiáng)的解鉀能力，解鉀量分別為（10.33±0.08）mg/L和（11.01±0.03）mg/L；菌株P(guān)L11和HY5具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA能力，分別為（34.01±0.01）mg/L和（32.41±0.08）mg/L；菌株HL3具有較強(qiáng)的固氮能力，但不具有解鉀和產(chǎn)生IAA的能力。

表1 細(xì)菌的促生活性

2.2 菌株的鹽堿耐受性

對(duì)菌株P(guān)J10、PL11、HL3、HJ9和HY5進(jìn)行鹽堿耐受性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。在pH=7時(shí)，各菌落直徑最大，菌落生長(zhǎng)良好。當(dāng)培養(yǎng)基pH值超過(guò)7，各菌落的直徑均呈降低趨勢(shì)，但不同菌株的表現(xiàn)存在差異。與pH=7中的菌落直徑比較，pH=8時(shí)，HJ9菌落直徑降低了39.55%，其生長(zhǎng)能力大幅下降；pH=9時(shí)，PL11和HL3的菌落直徑分別下降了8.73%和9.43%，而PJ10和HY5的菌落直徑僅降低了4.24%和4.32%；pH=10時(shí)，HJ9不能生長(zhǎng)，HL3生長(zhǎng)能力下降了54.45%；pH=11時(shí)，PJ10、HY5仍具有較好的生長(zhǎng)能力，PL11則下降了56.67%。

圖1 不同p H值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，在w（NaCl）=5.00%時(shí)，各菌落直徑最大，與其直徑相比，當(dāng)w（NaCl）=6.00%時(shí)，PL11菌落直徑下降了35.58%；w（NaCl）=8.00%時(shí)，PL11不能生長(zhǎng)，HL3和HJ9的生長(zhǎng)能力分別降低了24.02%和36.02%；w（NaCl）=9.00%時(shí)，HL3和HJ9的生長(zhǎng)能力繼續(xù)下降，較w（NaCl）=5.00%時(shí)降低了75.55%和55.94%，而HY5和PJ10僅下降了10.10%和11.92%。由此可知，菌株P(guān)J10、HY5、HL3在鹽脅迫和堿脅迫條件下均表現(xiàn)出較好的耐受能力，被確認(rèn)為目標(biāo)菌株。

圖2 不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.3 菌株的分類(lèi)鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定將菌株P(guān)J10、HL3和HY5于28℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落及菌體形態(tài)，其特征如圖3所示。

圖3 目標(biāo)菌株的形態(tài)特征

PJ10菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑干燥，邊緣整齊，培養(yǎng)基顏色無(wú)變化；菌體桿狀，（0.4～0.5）×（0.9～1.0）μm，有芽孢。

HL3菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，培養(yǎng)基顏色無(wú)明顯變化；菌體短桿狀，（0.3～0.4）×（0.5～0.8）μm，有芽孢。

HY5菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑干燥，邊緣整齊，培養(yǎng)基顏色無(wú)變化；菌體桿狀，（0.3～0.4）×（0.7～0.8）μm，有芽孢。

初步判斷3個(gè)菌株均為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

2.3.2 生理生化鑒定由表2可知，3個(gè)菌株的生理生化檢測(cè)結(jié)果符合芽孢桿菌屬細(xì)菌的鑒定特征。

表2 目標(biāo)菌株的生理生化特性

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定將3株目標(biāo)菌的基因測(cè)序結(jié)果錄入NCBI，獲得Genbank編號(hào)分別為PJ10菌株MW585077、HL3菌 株 MW585078、HY5菌 株MW585079。各菌株基因序列經(jīng)BLAST比較并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。PJ10菌株與壁芽孢桿菌（B.muralis）（MT598008）位于進(jìn)化樹(shù)同一分支，相似性為100%，見(jiàn)圖4。HL3菌株與短小芽孢桿菌（B.pumilus）264-LRN9（MF007158）位于進(jìn)化樹(shù)同一分支，同源性98.66%，見(jiàn)圖5。HY5菌株與萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）JCM9070（NR_024689）相似性為100%，見(jiàn)圖6。

圖4 菌株P(guān)J10系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 菌株HL3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6 菌株HY5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌分布廣泛，對(duì)鹽堿、高溫等脅迫條件具有一定抵抗能力，常被作為菌種篩選目標(biāo)[25]。從南通市沿海灘涂鹽堿地中篩選得到的巨大芽孢桿菌（B.megaterium）B7，具有產(chǎn)IAA能力、固氮能力、解磷能力和ACC脫氨酶活性，在w（NaCl）=6%的條件下可正常生長(zhǎng)[26]。枯草芽孢桿菌（B.subtilis）JC01具有溶磷和產(chǎn)鐵載體能力[27]。單純芽孢桿菌（B.simplex）SD5具有固氮和解磷作用[28]，但是2株菌的耐鹽堿能力不明。馬氏芽孢桿菌（B.marmarensis）在pH=12、（NaCl）=20%的條件下可正常生長(zhǎng)，其在盆栽實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的促生作用[29]。壁芽孢桿菌HS4具有產(chǎn)IAA能力，耐鹽堿能力不明[30]。短小芽孢桿菌JPVS11具有產(chǎn)IAA能力和ACC脫氨酶活性，且在w（NaCl）=9%的條件下能正常生長(zhǎng)[31]。萎縮芽孢桿菌GQJK17S8具有溶磷能力，且在w（NaCl）=10%的條件下能正常生長(zhǎng)[32]。這說(shuō)明芽孢桿菌屬中許多菌株具有促生能力，兼具耐鹽堿能力，是PGPR菌種的重要來(lái)源。

芽孢桿菌的耐鹽堿性主要依靠其耐鹽堿基因的表達(dá)。如枯草芽孢桿菌的基因組有編碼逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因mrp。這些逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可使微生物在極端鹽堿環(huán)境中維持菌體鹽離子平衡和酸堿度穩(wěn)態(tài)，使微生物具備抗鹽堿脅迫的能力[33—34]。蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）的全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，49個(gè)基因可能與其耐鹽堿性相關(guān)[35]。說(shuō)明芽孢桿菌耐鹽堿菌株的相關(guān)基因資源豐富，對(duì)其深入認(rèn)識(shí)有助于鹽堿地的科學(xué)利用和抗鹽堿性植物的基因工程育種。

本研究從3種典型鹽生植物的根際土壤中篩選獲得3株P(guān)GPR，分別為壁芽孢桿菌PJ10、短小芽孢桿菌HL3和萎縮芽孢桿菌HY5，其分別具有一定的固氮、解磷、解鉀、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體能力和ACC脫氨酶活性，在耐鹽堿性方面表現(xiàn)良好，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。

多株P(guān)GPR復(fù)配的復(fù)合型菌劑較單一菌種菌劑對(duì)植物的促生效果更強(qiáng)[36—37]。因此，有待對(duì)以上3株耐鹽堿PGPR開(kāi)展復(fù)配研究，以明確其最佳復(fù)配組合，為新型微生物肥料的開(kāi)發(fā)和利用提供技術(shù)支持。