曹漢洋，何禎祥，李志真，盧世明，鄭登耿，陳耀升，賴標禎

(1.福建省沙縣水南國有林場，福建 沙縣 365500； 2.南京大學生命科學學院，江蘇 南京 210046；3.福建省林業(yè)科學研究院，福建 福州 350012； 4.福州植物園，福建 福州 350012)

油茶(CamelliaoleiferaL.)是我國重要木本油料樹種，也是世界四大木本油料樹種之一，主要分布于我國南方省區(qū)[1]。其產(chǎn)品茶油是高級食用油，脂肪酸組成與橄欖油相似，長期食用十分有利于人體健康。油茶種植于山上，不與糧食爭地，為山區(qū)林農(nóng)提供大量的勞動就業(yè)機會。油茶產(chǎn)業(yè)是我國特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)既可以保障國家糧油安全，改善國民健康，又能促進林農(nóng)增收致富，助力山區(qū)脫貧，鄉(xiāng)村振興，經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益兼得，符合國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略需求，具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的推廣應用前景[2]。常規(guī)的油茶良種選育要經(jīng)過優(yōu)樹選擇—無性系測定—無性系區(qū)域試驗等程序，歷時十幾年，不能滿足生產(chǎn)實際對油茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)良種的迫切需求。

大量研究表明油茶無性系之間的產(chǎn)量差異極大，高產(chǎn)與低產(chǎn)之間差異巨大。目前，影響油茶產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的關鍵之一就是油茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的選育與應用。如何科學、準確、快速選擇高產(chǎn)無性系是擺在林木遺傳育種學家面前的重要科學問題。木本植物產(chǎn)量性狀是受多基因控制，而且與環(huán)境的影響也特別大，因此，單純從常規(guī)育種來選育高產(chǎn)油茶品種存在周期長等問題。國外新近的研究結果表明，通過各種現(xiàn)代分析技術如GC-MS，LC-MS，1H-NMR等，能夠獲得大量靶向或非靶向代謝表達譜[3-4]。目前，該技術在農(nóng)作物小麥、玉米[5-6]以及楊樹、花旗松、麻櫟等林木上[7-9]得到廣泛應用，但未見在油茶上應用的報道。生物標記的成功開發(fā)可用于準確篩選和預測高產(chǎn)的優(yōu)良無性系，將對林木育種計劃產(chǎn)生重要影響。本研究擬采用GC-MS技術，通過油茶高產(chǎn)與低產(chǎn)品種組代謝表達譜標記識別技術，從代謝表達譜的角度建立一套用于區(qū)分低產(chǎn)與高產(chǎn)油茶品種的方法，以期為油茶新品種選育提供參考。

1 試驗地概況

試驗點位于沙縣水南國有林場(117°46′E、26°21′N)，海拔240 m。年均氣溫15.6～19.6 ℃，年降水量1510～2000 mm，土壤為紅壤。試驗地進行清雜，開水平帶整地，帶寬1.5～2 m，穴規(guī)格60 cm×50 cm×40 cm，株行距(1.8～2.2)m×(2.5～3)m，種植密度約1500株·hm-2，油茶無性系評比試驗林于2011年春完成上山定植。造林后對試驗林進行撫育管理，每年除草撫育2次，上半年和下半年各1次，施肥1～2次，春季施復合肥100～350 g·株-1，隨著林齡增加，冬季隔年施有機肥1 kg·株-1。冬季進行適度修剪，剪除病蟲枝、過密枝、徒長枝等。

2 材料與方法

2.1 供試材料

在福建省沙縣水南國有林場的油茶無性系評比試驗林中選擇3株高產(chǎn)油茶樹，編號為A、B、C，2017—2019年單株平均產(chǎn)果量依次為2.62、2.35、1.5 kg，構建高產(chǎn)組；選擇3株低產(chǎn)油茶品種，編號為D、E、F，2017—2019年單株平均產(chǎn)果量依次為0.49、0.46、0.01 kg，構建低產(chǎn)組。

2.2 試驗方法

2020年5月12日在高產(chǎn)組和低產(chǎn)組每個單株上的上、中、下部位分別采集5個嫩芽，先按每株混合，然后每組進行混合。高產(chǎn)組和低產(chǎn)組各取新鮮混合樣品100 g，用無水甲醇1000 mL浸泡3 d，傾出溶劑并收集，重復3次，把3次所得溶液全部合并，然后減壓蒸干溶劑，高產(chǎn)組得深褐色膏狀物31.5 g，低產(chǎn)組得深褐色膏狀物30.8 g。將所得2組深褐色膏狀物分別用甲醇稀釋至1 mL，得到2組代謝物溶液。將2組代謝物溶液稀釋至0.05 mg·L-1進行GC-MS上機分析，GC條件為進樣量：2.00 μL；DB-5彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；氣化溫度280 ℃；程序升溫：初始溫度60 ℃，保留1 min，然后以10 ℃·min-1升至280 ℃，保留3 min；載氣為氦氣，分流比10∶1，載氣流速0.8 mL·min-1；峰面積歸一化法計算各化合物相對含量；紫外檢測器條件：波長254 nm；帶寬16 nm；稀釋因子：1.0000。MS條件為離子源：EI，電子能量70 eV；MS離子源溫度：230 ℃；MS四極桿溫度：150 ℃；采集模式：全掃描，掃描范圍20～650 amu；檢索譜庫：NIST譜庫；得到高產(chǎn)組和低產(chǎn)組代謝表達譜。將獲得的高產(chǎn)組和低產(chǎn)組代謝表達譜按相對含量進行排序，選擇具有含量顯著性差異的化合物。

3 結果與分析

3.1 油茶高產(chǎn)組和低產(chǎn)組代謝表達譜

根據(jù)GC-MS數(shù)據(jù)分析結果獲得的油茶高產(chǎn)組、低產(chǎn)組代謝表達譜見表1、表2。從表1、表2種看出，高產(chǎn)組共獲得34種代謝產(chǎn)物，低產(chǎn)組共獲得28種代謝產(chǎn)物。

3.2 與產(chǎn)量相關的代謝表達譜標記

根據(jù)油茶高產(chǎn)組和低產(chǎn)組代謝表達譜，按相對含量(>1%)得到差異表達標記(表3、表4)。高產(chǎn)組角鯊烯(保留時間17.718 min)的相對含量為4.07%，低產(chǎn)組角鯊烯(保留時間17.232 min)的相對含量為35.87%，顯著高于高產(chǎn)組(P<0.001)；保留時間17.227 min的化合物A在高產(chǎn)組中相對含量為31.85%，而在低產(chǎn)組中未檢測到。顯然，這2個代謝產(chǎn)物可作為潛在的油茶高產(chǎn)與低產(chǎn)無性系代謝表達譜標記。

表1 油茶高產(chǎn)組樣本代謝表達譜

表2 油茶低產(chǎn)組樣本代謝表達譜

表2(續(xù))

表3 油茶高產(chǎn)組和低產(chǎn)組樣本代謝表達譜標記

4 討論

油茶產(chǎn)量與茶油品質(zhì)除受自身遺傳特性影響外，還受到外界環(huán)境影響，這給油茶的高產(chǎn)品種選育帶來極大的困難。在優(yōu)良品種的選育上，大多限于單一指標的評價，研究者多限于從結實量、含油率、抗性等單一性狀考慮，往往缺乏對影響油茶產(chǎn)量和品質(zhì)的因素進行綜合評價。因此，研究遺傳特征和生物學特征等方面與油茶產(chǎn)量和品質(zhì)的關系可為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)油茶選育提供參考。

植物在生長發(fā)育過程中，其花芽分化階段的代謝物對植物發(fā)育的調(diào)控起著重要作用，在林木上有一些研究觀測到代謝物與產(chǎn)量的相互關系[9]。因此，植物代謝表達譜可能為育種和繁殖提供有用的篩選工具。目前，代謝表達譜標記在林木上應用還比較少。查到唯一發(fā)表的文獻是來自韓國的科學家Jun Won Kang等(2018)在Quercusacutissima無性系種子園中所作的研究[9]，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)無性系葉片中的蔗糖和肌醇的含量顯著高于低產(chǎn)無性系(P<0.05)；此外，高產(chǎn)無性系葉片中磷酸、琥珀酸、蘋果酸，莖中丁烷-1，3-二醇含量也高于低產(chǎn)無性系。本研究對3個高產(chǎn)和3個低產(chǎn)油茶無性系構建高產(chǎn)和低產(chǎn)BULK樣本組，進行花芽分化期間嫩芽中的代謝物差異分析，結果在油茶中首次發(fā)現(xiàn)角鯊烯和化合物A與油茶產(chǎn)量具有顯著相關性，角鯊烯的相對含量高產(chǎn)組為4.07%，低產(chǎn)組為35.87%，低產(chǎn)組顯著高于高產(chǎn)組(P<0.01)；保留時間為17.227 min的化合物A在高產(chǎn)組中相對含量為31.85%，而在低產(chǎn)組中沒有檢測到。雖然現(xiàn)在還無法確定這2個化合物與待測無性系的產(chǎn)量水平相關，但是作為一種新的選擇方法，對今后油茶無性系選育具有一定的參考價值。

Jun Won Kang等[9]在Quercusacutissima無性系種子園中除了對花芽分化期間的幼葉代謝物進行分析，另外還對植物體內(nèi)的內(nèi)源激素(IAA、ABA、(9G)Z、(7G)iP、iP、(9R)DZ、BA和cis-Z)水平進行測定。結果發(fā)現(xiàn)，(9G)Z的激素含量與林木生長、冠幅以及球果數(shù)量呈顯著負相關。對于油茶代謝表達譜的相關研究，除不同發(fā)育階段的代謝表達譜外，今后還應對植物內(nèi)源激素水平進行測定，以期在不同類型的代謝表達譜中發(fā)現(xiàn)更多與茶油產(chǎn)量性狀的標記，用于高產(chǎn)新品種的選育。