丁亮，茆軍，梅偉，王培民 ，黃利佳，廖太陽

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院 骨傷科，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是骨科常見病之一，它的主要病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨硬化或囊性變、關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生、滑膜病變、關(guān)節(jié)囊攣縮、韌帶松弛或攣縮、肌肉萎軟無力等[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，我國癥狀性KOA(診斷明確，存在膝關(guān)節(jié)疼痛等癥狀且需要就診)的患病率為8.1%，隨著我國人口老齡化程度加劇，該比例還會(huì)持續(xù)上升[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取分級治療方式治療KOA，可根據(jù)患病程度分別采取基礎(chǔ)治療(患者教育、運(yùn)動(dòng)治療、物理治療、行動(dòng)支持治療等)、藥物治療(口服鎮(zhèn)痛藥，關(guān)節(jié)腔藥物注射、口服中成藥等)、修復(fù)性治療(關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、軟骨修復(fù)手術(shù)、力線矯正手術(shù)等)和重建性治療(單髁置換術(shù)、全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)等)等方式治療，但都存在一定的局限性，包括藥物副作用、手術(shù)副作用、假體使用年限等[3]。中醫(yī)將KOA歸為“痹證”“骨痹”“筋痹”等范疇，現(xiàn)統(tǒng)稱為“膝痹”，證屬本虛標(biāo)實(shí)、本痿標(biāo)痹。主要病因病機(jī)為肝腎不足、風(fēng)寒濕邪侵襲機(jī)體，導(dǎo)致膝部筋絡(luò)氣血不通，故而為痛為腫。溫腎宣痹湯是王培民教授由多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來，該方以溫補(bǔ)腎陽、祛風(fēng)除濕之藥為主，補(bǔ)氣強(qiáng)骨、利水滲濕、行氣活血止痛之藥為輔，強(qiáng)筋健骨同時(shí)用以利水藥疏利關(guān)節(jié)，補(bǔ)瀉并進(jìn)，滋而不膩，諸藥合用共奏溫補(bǔ)腎陽、祛風(fēng)除痹之功[4]。盡管該方臨床取得了一定療效，然而具體作用機(jī)制尚待研究，本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，就溫腎宣痹湯治療KOA的潛在作用機(jī)制加以探討，為基礎(chǔ)研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

本研究使用的數(shù)據(jù)庫及軟件如下：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，人類基因數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Database，GeneCards)，人類基因及遺傳疾病在線目錄(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫，蛋白互作與功能富集分析平臺(tái)(STRING)，Cytoscape軟件，R語言軟件，Perl軟件。見表1。

表1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件

1.2 溫腎宣痹湯有效成分庫及靶基因庫

登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以附子、桂枝、牛膝、獨(dú)活、桑寄生、薏苡仁、白術(shù)、秦艽、黃芪、威靈仙、炙甘草為關(guān)鍵詞，檢索目前已知的每味中藥所含的有效成分，并進(jìn)行初步篩選，條件為：口服生物利用度(OB)>30%，生物類藥性(DL)>0.18；構(gòu)建溫腎宣痹湯的有效成分庫，同時(shí)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢以上重要的有效成分的作用靶點(diǎn)，并通過Perl軟件構(gòu)建靶基因庫。

1.3 KOA靶基因庫構(gòu)建

以knee osteoarthritis為關(guān)鍵詞，分別檢索GeneCards及OMIN數(shù)據(jù)庫，合并所查得的有關(guān)KOA相關(guān)的靶點(diǎn)，篩選并構(gòu)建KOA相關(guān)靶基因庫。

1.4 交集基因庫構(gòu)建

使用R語言軟件及Perl軟件，取得溫腎宣痹湯與KOA靶點(diǎn)基因的交集基因，并繪制Veen圖，得到溫腎宣痹湯-KOA共同靶點(diǎn)基因。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶基因篩選

將通過上述步驟得到的溫腎宣痹湯-KOA共同靶點(diǎn)基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple Proteins Search，限定物種為Homo sapiens，保存下載TSV格式的分析結(jié)果，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并通過R語言計(jì)算每個(gè)靶點(diǎn)基因的度值(即靶點(diǎn)基因之間的相互連接數(shù)目)，取大于平均度值的靶基因?yàn)楹诵陌谢颉?/p>

1.6 藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape軟件對STRING網(wǎng)站得到的結(jié)果與溫腎宣痹湯有效成分以及共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析，構(gòu)建藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)大小及顏色進(jìn)行調(diào)整。

1.7 GO基因本體論與KEGG富集分析

將所得到的溫腎宣痹湯-KOA共同靶標(biāo)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析計(jì)算，得出GO功能富集分析與KEGG富集分析的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 溫腎宣痹湯有效成分庫及靶基因庫

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以附子、桂枝、牛膝、獨(dú)活、桑寄生、薏苡仁、白術(shù)、秦艽、黃芪、威靈仙、炙甘草為檢索詞，設(shè)置OB和DL參數(shù)，篩選后共得到196個(gè)有效成分，對應(yīng)靶點(diǎn)222個(gè)。見表2(僅部分顯示)。

表2 篩選后溫腎宣痹湯有效成分及其OB、DL

2.2 KOA相關(guān)基因庫

以knee osteoarthritis為檢索詞，分別檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫以及OMIM數(shù)據(jù)庫，共得到KOA相關(guān)靶點(diǎn)基因2 064個(gè)。

2.3 溫腎宣痹湯-KOA交集基因庫

將上述檢索得到的222個(gè)中藥靶點(diǎn)基因與KOA相關(guān)靶點(diǎn)基因取交集，得到溫腎宣痹湯-膝骨性關(guān)節(jié)炎共同靶點(diǎn)基因116個(gè)，并使用R語言軟件繪制Veen圖。見圖1。

圖1 溫腎宣痹方與KOA靶點(diǎn)基因交集Venn圖

2.4 PPI網(wǎng)路構(gòu)建及核心靶點(diǎn)基因篩選

將上述得到的116個(gè)中藥-疾病共同靶點(diǎn)輸入“STRING”數(shù)據(jù)庫，設(shè)置相關(guān)條件后運(yùn)行得到靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。同時(shí)以大于平均度值為條件，篩選得到57個(gè)核心靶點(diǎn)基因，見圖3。

圖2 溫腎宣痹方治療KOA靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白互作核心靶點(diǎn)條圖

2.5 藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape軟件整合分析中藥復(fù)方溫腎宣痹湯的核心有效成分以及對應(yīng)的藥物作用靶標(biāo)基因與股骨頭壞死疾病共同基因之間的關(guān)系，構(gòu)成溫腎宣痹湯-靶基因-KOA疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。見圖4。

圖4 溫腎宣痹方-藥物成分-靶基因-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO基因本體論與KEGG富集分析

對核心靶基因進(jìn)行GO本體論分析，得出溫腎宣痹湯治療KOA的核心分子功能主要涉及細(xì)胞因子活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核激素受體結(jié)合、雌激素受體結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、激素受體結(jié)合、核受體結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等。見圖5、6。

圖6 GO基因本體論分析柱狀圖

KEGG富集分析顯示，共篩選出溫腎宣94條溫腎宣痹湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的潛在通路。主要涉及AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等，見圖7、8。

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

溫腎宣痹湯是王培民教授在多年臨床實(shí)踐中探索而來的，該方由附子、桂枝、牛膝、獨(dú)活、桑寄生、薏苡仁、白術(shù)、秦艽、黃芪、威靈仙、炙甘草等組成。重用附子以溫腎扶陽、散寒止痛；桂枝辛溫，溫表陽以固衛(wèi)氣，又祛風(fēng)濕；白術(shù)健脾利濕化水，通經(jīng)絡(luò)，配以薏苡仁增強(qiáng)其健脾利濕化水之功，緩解寒飲造成的疼痛；獨(dú)活辛苦微溫，祛伏邪之風(fēng)，除蘊(yùn)久之痹；秦艽、威靈仙共奏祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、通利關(guān)節(jié)之效，桑寄生、牛膝補(bǔ)益肝腎而強(qiáng)壯筋骨，輔以甘草，調(diào)和諸藥，輔以補(bǔ)益中焦，助扶正祛邪之用。

通過篩選我們共得到該方的有效成分196個(gè)，通過檢索得到其對應(yīng)靶點(diǎn)222個(gè)，通過與KOA疾病靶點(diǎn)取交集后得到了57個(gè)核心靶點(diǎn)，其中評分前3名的靶點(diǎn)基因依次為IL-16、蛋白激酶B(PKB/AKT1)、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGFA)。IL-6是一種炎癥介導(dǎo)因子，在人體各種炎癥過程中起到重要作用[5]。它由184個(gè)氨基酸組成，有兩種受體亞型，分別是mIL-6R-α和sIL-6R[6]。研究表明，KOA患者關(guān)節(jié)滑膜液與軟骨組織的IL-6表達(dá)水平較正常軟骨組織升高[7-8]，且血清IL-6的濃度與KOA患者疼痛程度及影像學(xué)嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9]，表明IL-6參與KOA的生理病理過程。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT)是磷脂酰肌醇激酶(PI3K)信號通路中重要的下游靶點(diǎn)，AKT1是其亞型之一。PI3K/AKT信號通路是軟骨細(xì)胞存活和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，除調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，還可通過抑制軟骨細(xì)胞死亡來減少軟骨退變，是對抗軟骨細(xì)胞凋亡的重要途徑[10]。PI3K/AKT/mTOR是骨關(guān)節(jié)炎(OA)中軟骨下骨的關(guān)鍵代謝途徑。創(chuàng)傷后OA小鼠模型軟骨下骨中AKT磷酸化增加，促進(jìn)成骨分化和成骨細(xì)胞增殖，導(dǎo)致異常骨形成[11]。VEGF是一種具有重要促血管生成活性的生長因子，它同時(shí)也是炎癥細(xì)胞因子。它作用于多種細(xì)胞類型，具有多種功能，其功能包括刺激血管生成、單核細(xì)胞趨化、增強(qiáng)血管通透性和血管舒張等[12]。在晚期OA的關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、滑膜液、軟骨下等部位均可檢測出VEGF表達(dá)，且與病情嚴(yán)重程度及疼痛程度呈正相關(guān)[13-15]。在VEGF家族中，VEGFA是在OA發(fā)病機(jī)制中被研究最多的亞型。有研究人員發(fā)現(xiàn)，VEGFA可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白(MMPs)分泌，通過抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的合成和表達(dá)來抑制關(guān)節(jié)軟骨的變性[16]。

KEGG分析共得到94條相關(guān)通路，在排除與KOA關(guān)聯(lián)性較小的通路后，我們團(tuán)隊(duì)認(rèn)為溫腎宣痹湯治療KOA主要通過IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路發(fā)揮作用。IL-17是多種炎癥細(xì)胞因子之一，存在于關(guān)節(jié)滑膜及軟骨細(xì)胞中。OA患者血清和滑液中IL-17水平升高，且與病變的X線圖像所示嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[17-19]。IL-17能抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖，促進(jìn)MMPs組酶的產(chǎn)生[20]。此外，IL-17影響其他細(xì)胞因子和化合物的分泌，進(jìn)而影響OA進(jìn)程[21]。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)是免疫球蛋白家族的成員，是晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的受體，多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞均可表達(dá)[22]，AGEs即高級糖基化終產(chǎn)物，是RAGE的配體，由蛋白質(zhì)與糖的糖基化而形成的[23]，RAGE參與激活促炎反應(yīng)和各種炎癥基因有關(guān)的關(guān)鍵信號通路。一方面，AGEs通過激活包括軟骨細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的核因子(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)來誘導(dǎo)炎癥[24]。另一方面，AGEs可能通過MAPK途徑增加PGE2和NO水平，增強(qiáng)OA軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[25]。腫瘤壞死因子(TNF)超家族在免疫、炎癥和控制細(xì)胞分化、增殖和凋亡中起著關(guān)鍵作用[26]。在OA患者中，滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中的TNF水平均升高，現(xiàn)有研究表明，TNF可抑制軟骨細(xì)胞中蛋白多糖、連接蛋白和Ⅱ型膠原的合成，刺激MMP-1、MMP-3和MMP-13，28的釋放，誘導(dǎo)IL-6和趨化因子的產(chǎn)生[6,27]。

圖8 KEGG功能富集分析柱狀圖

通過以上分析，我們團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，溫腎宣痹湯治療KOA主要是通過通過AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路，作用于IL-6、AKT1、VEGFA等核心靶點(diǎn)，發(fā)揮控制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、抵抗氧化應(yīng)激等作用，從而控制疾病的發(fā)生發(fā)展，體現(xiàn)了多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)、多方向的特點(diǎn)，這符合中醫(yī)學(xué)整體與系統(tǒng)論治的觀念。未來還需進(jìn)一步進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的實(shí)驗(yàn)，以研究溫腎宣痹湯治療OA的確切分子作用機(jī)制。