趙剛，武青生，趙延禮，馬生彪，王巍，穆元忠

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖失控，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其治療失敗的主要原因[1]。目前，結(jié)腸癌的病因和發(fā)病分子機(jī)制尚未完全清楚，探討影響結(jié)腸癌細(xì)胞惡性行為的分子機(jī)制對(duì)于闡明結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的及尋找治療靶點(diǎn)意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lnc RNA）參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控的長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其表達(dá)失調(diào)與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切[2-3]。lncRNA NR2F1-AS1是核受體亞族2F組成員1（nuclear receptor subfamily 2 group F member 1，NR2F1）的反義 RNA，研究顯示，其在肝細(xì)胞癌[4]、骨肉瘤[5]等腫瘤中表達(dá)升高，干擾NR2F1-AS1表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。但NR2F1-AS1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其作用還未知。微小RNA（miRNA）在腫瘤進(jìn)展中也起重要調(diào)控作用[6]。lnc RNA可調(diào)控miRNA的表達(dá)，兩者共同參與腫瘤進(jìn)程[7]。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-145-5p可能是NR2F1-AS1的靶基因。有報(bào)道顯示miR-145-5p在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-145-5p可抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲，為結(jié)直腸癌的治療提供了潛在治療靶點(diǎn)[8]。目前，NR2F1-AS1能否靶向miR-145-5p調(diào)控結(jié)腸癌進(jìn)展還未知。本研究主要探討了NR2F1-AS1和miR-145-5p對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞惡性行為的影響，分析NR2F1-AS1對(duì)miR-145-5p的靶向調(diào)控作用，以期從lncRNA/miRNA途徑揭示結(jié)腸癌進(jìn)展的機(jī)制，并為結(jié)腸癌治療靶點(diǎn)選擇提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年3月至2017年5月青海省第五人民醫(yī)院外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性結(jié)腸腺癌組織25例，另留取距腫瘤邊緣3 cm的癌旁組織（正常結(jié)腸組織）。其中男16例，女9例，年齡（61.25±5.78）歲。組織高分化7例，中分化9例，低分化9例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，未轉(zhuǎn)移11例。病人術(shù)前未進(jìn)行放、化療等治療。病人或其近親屬簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒、LipofectamineTM2000試劑盒、雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司），si-NR2F1-AS1、si-NC、pcDNA-NR2F1-AS1、pcDNA、miR-145-5p mimcs、miR-NC、anti-miR-145-5p、antimiR-NC（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA抽提試劑盒和PCR試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR引物（上海生工生物工程公司），鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗體（北京中杉金橋生物試劑公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HCT116細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HCT116細(xì)胞，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、濕度97%、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代。

1.3.2 NR2F1-AS1與miR-145-5p靶向關(guān)系驗(yàn)證生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，NR2F1-AS1與miR-145-5p結(jié)合的核苷酸序列。PCR擴(kuò)增含miR-145-5p結(jié)合位點(diǎn)的NR2F1-AS1核苷酸序列，插入載體，構(gòu)建NR2F1-AS1野生型熒光素酶報(bào)告載體（WT-NR2F1-AS1）。同時(shí)，將結(jié)合位點(diǎn)突變后構(gòu)建NR2F1-AS1突變型熒光素酶報(bào)告載體（MUT-NR2F1-AS1）。用LipofectamineTM2000試劑盒分別將WT-NR2F1-AS1、MUT-NR2F1-AS1與miR-145-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染。24 h后，收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。具體操作參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書。分別轉(zhuǎn)染si-NR2F1-AS1、si-NC、pcDNA-NR2F1-AS1及pcDNA至HCT116細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-145-5p表達(dá)水平。

1.3.3 RT-qPCR檢測(cè)組織或細(xì)胞中NR2F1-AS1和miR-145-5p表達(dá)水平 RNA提取試劑盒分離總RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度后將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。再以cDNA為模板，行PCR擴(kuò)增。NR2F1-AS1正向5'-CAGCGGTGCAAACCATGTGC-3'，反向5'-GTAAACCAAGTCGGTTGAACG-3'；GAPDH正向5'-CAGTGCCAGCCTCGTCTATG APDH-3'，反 向 5'-CTTCTGACACCTACCGGGGA-3'；miR-145-5p 正向 5'-CCAGCTGGGCTCA CTGAACAATGA-3'，反向 5'-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；U6 正向 5'-TGCGGGTG CTCGCTTCGGCAGC-3'，反向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。 GAPDH 為NR2F1-AS1的內(nèi)參，U6為miR-145-5p的內(nèi)參，用2－ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 取1×105個(gè)HCT116細(xì)胞接種6孔板，用Lipofectami-neTM2000分別將si-NR2F1-AS1（si-NR2F1-AS1組）、si-NC（si-NC組）、miR-145-5p mimcs（miR-145-5p 組）、miR-NC（miRNC組）、si-NR2F1-AS1與anti-miR-145-5p（si-NR2F1-AS1+anti-miR-145-5p組）、si-NR2F1-AS1與 anti-miR-NC（si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組）轉(zhuǎn)染60%融合的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將CCK溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶9混合，在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，取100 μL加入各孔內(nèi)孵育，全自動(dòng)酶標(biāo)儀在4 h后于450 nm處測(cè)定吸光度（optical density，OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 侵襲實(shí)驗(yàn)：將無(wú)血清培養(yǎng)基和Matrigel按照8∶1混合，取50 μL鋪于Transwell上室備用。用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸各組HCT116細(xì)胞調(diào)整濃度為5×104個(gè)/毫升。在上室、下室中分別加入100 μL細(xì)胞懸液、500 μL完全培養(yǎng)基。孵育48 h后取出上室。將Transwell膜下表面的細(xì)胞分別用4%多聚甲醛固定、0.4%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)：無(wú)需鋪設(shè)Matrigel基質(zhì)膠，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA法提取總蛋白后進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白置于100℃煮沸5 min。冷卻至室溫后，每組樣本取30 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行膜的封閉。用一抗孵育液在4℃孵育膜10 h。洗膜后，再用二抗孵育液在37℃孵育膜1 h。洗膜后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色、凝膠成像系統(tǒng)拍照。以Image J軟件分析蛋白條帶相對(duì)內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中NR2F1-AS1和miR-145-5p的表達(dá)與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織中NR2F1-AS1表達(dá)升高，miR-145-5p表達(dá)降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 NR2F1-AS1和miR-145-5p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)/±s

表1 NR2F1-AS1和miR-145-5p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)/±s

注：①與癌旁組織比較，P<0.05。

組別癌旁組織結(jié)腸癌組織t值P值miR-145-5p 1.00±0.08 0.55±0.05①23.85 0.000例數(shù)25 25 NR2F1-AS1 1.01±0.11 3.39±0.33①34.21 0.000

2.2 NR2F1-AS1靶向調(diào)控miR-145-5p的表達(dá)NR2F1-AS1與miR-145-5p序列存在結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-NR2F1-AS1的miR-145-5p組細(xì)胞熒光素酶活性為0.49±0.05，低于miR-NC組1.03±0.09（t=15.735，P<0.001）；而共轉(zhuǎn)染 MUT-NR2F1-AS1的miR-145-5p組細(xì)胞熒光素酶活性為1.01±0.08，與miR-NC組細(xì)胞熒光素酶活性1.00±0.07比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.282，P=0.781）。pcDNANR2F1-AS1組miR-145-5p表達(dá)水平為0.44±0.04，低于 pcDNA 組 1.00±0.08（t=18.783，P<0.001）。 si-NR2F1-AS1組miR-145-5p表達(dá)水平為2.88±0.27，高于si-NC組0.98±0.09（t=20.028，P<0.001）。

圖1 NR2F1-AS1的序列中含有與miR-145-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.3 干擾NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響與si-NC組相比，si-NR2F1-AS1組細(xì)胞中NR2F1-AS1表達(dá)水平降低（P<0.05），表明轉(zhuǎn)染si-NR2F1-AS1可干擾NR2F1-AS1表達(dá)。與si-NC組比較，si-NR2F1-AS1組P21蛋白水平高于si-NC組（P<0.05），CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平以及OD值、遷移和侵襲數(shù)低于si-NC組（P<0.05）。見(jiàn)圖2和表2。

圖2 干擾NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲影響的相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 干擾NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表2 干擾NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，P21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9。

組別MMP-9蛋白重復(fù)次數(shù)NR2F1-AS1 OD值（450 nm）24 h 48 h 72 h遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白si-NC si-NR2F1-AS1 t值P值0.72±0.07 0.30±0.03 16.545 0.000 9 9 1.01±0.09 0.53±0.05 13.987 0.000 0.61±0.06 0.52±0.04 3.744 0.002 1.21±0.11 0.68±0.06 12.690 0.000 1.62±0.13 0.87±0.07 19.099 0.000 126.39±11.43 61.48±6.57 14.771 0.000 108.26±10.22 52.47±5.63 14.344 0.000 0.63±0.06 0.25±0.03 16.994 0.000 0.33±0.03 0.78±0.07 17.726 0.000 0.69±0.06 0.27±0.03 18.783 0.000

2.4 miR-145-5p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響miR-145-5p組細(xì)胞miR-145-5p表達(dá)水平高于miR-NC組（P<0.05），表明轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimics能夠上調(diào)miR-145-5p表達(dá)水平。miR-145-5p組細(xì)胞P21蛋白水平高于miR-NC組（P<0.05），而CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、OD值、遷移和侵襲數(shù)低于miR-NC組（P<0.05）。見(jiàn)圖3和表3。

圖3 miR-145-5p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲影響的相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 miR-145-5p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表3 miR-145-5p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，P21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9。

分組重復(fù)次數(shù)p21蛋白miR-145-5p 48 h 72 h遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)CyclinD1蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白OD值（450 nm）24 h miR-NC miR-145-5p t值P值1.00±0.071.25±0.101.66±0.14123.48±12.41103.59±10.360.61±0.060.32±0.030.68±0.060.74±0.07 0.35±0.03 15.363 0.000 9 9 2.84±0.27 19.790 0.000 0.62±0.06 0.59±0.05 1.152 0.266 0.74±0.07 12.534 0.000 0.96±0.08 13.024 0.000 68.36±6.58 11.772 0.000 59.33±5.42 11.356 0.000 0.28±0.03 14.758 0.000 0.71±0.07 15.363 0.000 0.33±0.03 15.652 0.000

2.5 抑制miR-145-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用si-NR2F1-AS1+anti-miR-145-5p組細(xì)胞CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平以及OD值、遷移和侵襲數(shù)高于si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組，miR-145-5p表達(dá)水平和P21蛋白水平低于si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組（P<0.05）。見(jiàn)圖4和表4。

圖4 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制miR-145-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用（xˉ±s，n=9）

3 討論

Lnc RNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子。NR2F1-AS1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)控腫瘤發(fā)展進(jìn)程的lnc RNA。Guo等[9]研究顯示，NR2F1-AS1在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，其通過(guò)靶向上調(diào)miR-338-3P 表達(dá)抑制甲狀腺癌進(jìn)展。Wang等[10]研究顯示，NR2F1-AS1在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)升高，抑制NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)移能力具有顯著抑制作用，這與其靶向上調(diào)miR-363表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中NR2F1-AS1表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，提示NR2F1-AS1可能參與結(jié)腸癌啟動(dòng)和發(fā)展。轉(zhuǎn)染si-NR2F1-AS1至結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示干擾NR2F1-AS1表達(dá)可降低HCT116細(xì)胞活力，減少遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，同時(shí)伴有促增殖蛋白CyclinD1、促轉(zhuǎn)移蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)下降以及抗增殖蛋白P21蛋白的表達(dá)升高，提示NR2F1-AS1可能是結(jié)腸癌的潛在治療靶點(diǎn)。

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-145-5p可能是NR2F1-AS1的靶基因。為探討NR2F1-AS1抗結(jié)腸癌的可能機(jī)制，本研究開(kāi)展雙熒光素酶報(bào)告基因法證實(shí)NR2F1-AS1可與miR-145-5p直接結(jié)合。隨后的分析顯示干擾NR2F1-AS1能夠促進(jìn)miR-145-5p表達(dá)，而NR2F1-AS1過(guò)表達(dá)則對(duì)miR-145-5p水平具有抑制作用，提示結(jié)腸癌中存在NR2F1-AS1/miR-145-5p 分子軸。miR-145-5p 在前列腺癌[11]、膀胱癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[13]等腫瘤中表達(dá)降低，作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，miR-145-5p在結(jié)腸癌組織中呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-145-5p可抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[8]，證實(shí)miR-145-5p在結(jié)腸癌中的抑癌作用，提示上調(diào)miR-145-5p表達(dá)有助于阻礙結(jié)腸癌進(jìn)程。本研究還顯示，干擾miR-145-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾NR2F1-AS1表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示干擾NR2F1-AS1表達(dá)通過(guò)靶向上調(diào)miR-145-5p表達(dá)發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。

總之，在結(jié)腸癌組織NR2F1-AS1表達(dá)升高，干擾NR2F1-AS1可能通過(guò)上調(diào)miR-145-5p表抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞惡性行為，發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用，是結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。但本研究還存在不足之處，僅在細(xì)胞層面探討了NR2F1-AS1對(duì)結(jié)腸癌的影響，接下來(lái)將通過(guò)裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步探討NR2F1-AS1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及其它可能的調(diào)控機(jī)制。