張承中，尹占海，李存寬，王成龍

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中的多能干細胞，具有強大分化潛能[1]，已用于多種疾病的治療。如BMSCs可分化為神經細胞，用于治療阿爾茨海默病[2]；BMSCs還用于相關骨疾病的治療[3]。尋找有效促進骨髓間充質干細胞增殖，抑制細胞凋亡的方法對治療相關疾病具有重要意義。氟伐他汀是臨床上常用的降血脂類藥物，氟伐他汀可改善骨質疏松大鼠骨組織的骨生物力學性能和形態(tài)學結構[4]。有研究發(fā)現氟伐他汀可抑制晚期糖基化終產物誘導的血管平滑肌細胞增殖，遷移和細胞外基質積累[5]。氟伐他汀可抑制T淋巴細胞白血病細胞增殖、促進細胞凋亡[6]。Sirtuin-3（Sirt3）是sirtuin蛋白脫乙酰酶家族的重要成員之一，沉默Sirt3通過干擾脂肪來源的人間充質干細胞的線粒體功能而導致成脂分化和胰島素抵抗受損[7]。有研究發(fā)現Sirt3可以減少過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞凋亡[8]。本實驗自2019年1―8月研究氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞增殖凋亡的影響，探尋其機制是否與Sirt3有關。

1 材料與方法

1.1 材料胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司；氟伐他汀購自北京諾華制藥有限公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京碧云天生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒購自日本同仁研究所。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離培養(yǎng) 取2只清潔級4周齡SD大鼠（購自上海凱學生物科技有限公司），將SD大鼠麻醉處死，用75%乙醇浸泡15 min后在超凈工作臺中取大鼠雙側股骨，PBS反復沖洗干凈，用含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將沖洗出的髓狀物接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液一次，顯微鏡下觀察細胞生長情況，當融合度在80%左右時進行消化傳代，取3代后細胞用于實驗。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.2.2 細胞處理和分組 實驗分為正常組、模型組、三個干預組、干預組2+si-NC、干預組2+si-Sirt3；將BMSCs用400 μmol/L的過氧化氫培養(yǎng)6 h作為模型組；將BMSCs用400 μmol/L的過氧化氫培養(yǎng)的同時分別加入0.01、0.1、1 μmol/L氟伐他汀作為三個干預組；未添加任何物質正常培養(yǎng)的細胞作為正常組；將si-NC、si-Sirt3轉染至BMSCs中再用400 μmol/L的過氧化氫、0.1 μmol/L氟伐他汀處理作為干預組2+si-NC組、干預組2+si-Sirt3組。

1.2.3 蛋白質印跡（Western Blotting）法檢測蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，經電泳將蛋白轉至PVDF上，封閉1 h后分別加入Cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、Sirt3一抗（1∶1 000），4 ℃過夜；再加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h；顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 MTT檢測細胞存活率 各組細胞培養(yǎng)48 h時，加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h后加入150 μL的DMSO，振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm吸光度（OD）值。細胞存活率（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，按照試劑盒說明書，分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，孵育后上流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法實驗數據使用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。觀測資料主要為計量數據，以±s表示。兩組間數據比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析+多重比較HSD-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氟伐他汀對過氧化氫誘導的BMSCs細胞增殖的影響與正常組相比，模型組細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表達水平、細胞存活率顯著降低，P21表達水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，氟伐他汀三個干預組Cyclin D1表達水平、細胞存活率顯著升高，P21表達水平顯著降低（P<0.05）。見圖1，表1。

圖1 增殖相關蛋白的表達

表1 氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）增殖的影響/±s

表1 氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）增殖的影響/±s

注：Cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A。①與正常組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

重復次數9 9 9 9 9 Cyclin D1 0.78±0.08 0.14±0.01①0.25±0.02②0.48±0.05②0.46±0.04②241.78 0.000組別正常組模型組干預組1干預組2干預組3 F值P值P21 0.22±0.02 0.84±0.08①0.60±0.06②0.43±0.04②0.40±0.03②191.74 0.000存活率/%100.40±10.23 41.57±4.32①50.03±5.08②79.72±8.00②76.42±7.48②96.84 0.000

2.2 氟伐他汀對過氧化氫誘導的BMSCs細胞凋亡的影響與正常組相比，模型組Bax表達水平、細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，氟伐他汀三個干預組Bax達水平、細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖2，表2。

圖2 氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）凋亡及凋亡蛋白表達的影響

表2 氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

表2 氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

注：①與正常組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

分組正常組模型組干預組1干預組2干預組3 F值P值凋亡率/%8.28±0.92 38.57±4.04①32.05±3.25②16.17±1.83②17.06±1.75②211.22 0.000重復次數9 9 9 9 9 Bax 0.17±0.02 0.79±0.08①0.62±0.06②0.35±0.04②0.33±0.03②229.03 0.000 Bcl-2 0.91±0.09 0.23±0.02①0.36±0.03②0.59±0.06②0.60±0.06②175.18 0.000

2.3 氟伐他汀對過氧化氫誘導的BMSCs細胞中Sirt3表達的影響與正常組相比，模型組Sirt3表達水平顯著降低[（0.31±0.03）比（1.01±0.10），P<0.05]；與模型組相比，氟伐他汀干預組2中Sirt3表達水平顯著升高[（0.68±0.07）比（0.31±0.03），P<0.05]。見圖3。

圖3 Sirt3蛋白的表達

2.4 抑制Sirt3能逆轉氟伐他汀對過氧化氫誘導的BMSCs細胞增殖的作用與干預組2+si-NC組相比，干預組2+si-Sirt3組中Sirt3、Cyclin D1表達水平、細胞存活率顯著降低，P21表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖4，表3。

圖4 Sirt3和增殖相關蛋白的表達

表3 抑制Sirt3能逆轉氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）增殖的影響/±s

表3 抑制Sirt3能逆轉氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）增殖的影響/±s

組別干預組2+si-NC干預組2+si-Sirt3 t值P值重復次數9 9 Sirt3 0.70±0.07 0.36±0.04 12.652 0.000 Cyclin D1 0.50±0.05 0.25±0.02 13.927 0.000 P21 0.40±0.04 0.72±0.07 11.907 0.000存活率/%80.19±8.07 47.29±4.82 10.498 0.000

2.5 抑制Sirt3能逆轉氟伐他汀對過氧化氫誘導的BMSCs細胞凋亡的作用與干預組2+si-NC組相比，干預組2+si-Sirt3組中Bax表達水平、細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2表達水平顯著降低（P<0.05）。見圖5，表4。

圖5 抑制Sirt3能逆轉氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）凋亡及凋亡蛋白表達的影響：A為細胞凋亡圖；B為凋亡相關蛋白的表達

表4 抑制Sirt3能逆轉氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

表4 抑制Sirt3能逆轉氟伐他汀對過氧化氫誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）凋亡的影響/±s

注：Bax為Bcl相關X，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。

組別凋亡率/%重復次數Bax Bcl-2干預組2+si-NC9 0.33±0.030.57±0.0615.96±2.00干預組2+si-Sirt390.70±0.070.28±0.0333.17±3.46 t值14.5812.9712.92 P值0.0000.0000.000

3 討論

BMSCs能分化為成骨細胞、軟骨細胞和成纖維細胞等，其因體外擴增繁殖能力強而被廣泛用于治療骨質疏松、骨關節(jié)炎等骨損傷[9]。研究發(fā)現氧化應激可影響B(tài)MSCs的活性，因此提高BMSCs的抗氧化應激能力有利于其移植治療成功[10]。本實驗用過氧化氫處理BMSCs，結果顯示細胞存活率降低，細胞凋亡率升高。表明過氧化氫可以抑制BMSCs增殖，誘導BMSCs凋亡。有研究發(fā)現辛伐他汀可促進大鼠髓核間充質干細胞增殖和細胞外基質的分泌[11]。氟伐他汀可以增加類風濕性關節(jié)炎患者的骨保護素水平并改善疾病活動性變量[12]。氟伐他汀還能減少活性氧的產生，減少脂多糖誘導的體內破骨細胞生成和骨侵蝕[13]。說明氟伐他汀具有抗氧化能力和保護骨損傷的功能。本實驗用不同濃度的氟伐他汀處理過氧化氫作用的BMSCs，結果顯示，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，表明不同濃度的氟伐他汀均可促進BMSCs增殖，抑制過氧化氫作用的BMSCs凋亡。提示氟伐他汀具有保護BMSCs使其免受損傷的作用。

Sirt3具有抗氧化作用[14]，有研究發(fā)現老年人間充質基質/干細胞中Sirt3的減少增加了細胞對氧化應激的敏感性[15]。過表達Sirt3可降低氧化應激水平并增強間充質干細胞的壽命和分化能力[16]。Sirt3轉染骨髓間充質干細胞促進了細胞的增殖和分化[17-18]。表明Sirt3促進間充質干細胞增殖分化的作用。本實驗結果顯示，過氧化氫作用的BMSCs中Sirt3表達水平降低，氟伐他汀處理后Sirt3表達水平升高，抑制Sirt3表達逆轉了氟伐他汀對過氧化氫誘導的BMSCs增殖抑制和凋亡促進作用。提示，氟伐他汀可能通過調控Sirt3影響過氧化氫誘導的BMSCs的增殖和凋亡。

綜上所述，氟伐他汀能抑制過氧化氫誘導的BMSCs細胞凋亡，促進細胞增殖，其機制可能與上調Sirt3有關。將可為減輕BMSCs氧化應激，提高其移植治療成功率提供理論參考和依據。