胡彬雅 李赟 敬云龍 趙斯君

喉乳頭狀瘤為喉部常見的良性腫瘤，與人乳頭狀瘤病毒感染有關(guān)，惡變者多見于中年以上的患者[1]。幼兒型喉乳頭瘤與病毒感染及慢性刺激有關(guān)，可發(fā)生于任何年齡，10歲以下兒童更為多見，具有多發(fā)性、生長(zhǎng)快，易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[2]。外泌體(exosome)是由細(xì)胞分泌的納米級(jí)小囊泡，幾乎可由所有細(xì)胞分泌獲得，可以作為信息載體在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)和信息的傳遞[3]。外泌體內(nèi)包含多種不同分子，如：蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA和miRNA，其中微小核糖核酸(miRNA)在基因表達(dá)調(diào)控上有著重要作用，并證實(shí)外泌體與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、免疫耐受以及耐藥性密切相關(guān)[4]。外泌體中的miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其通過與靶基因特異性結(jié)合可參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控[5]。據(jù)報(bào)道，由外泌體介導(dǎo)的miR-577在多種腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)，被認(rèn)為是一種有效的抑癌分子[6],且miR-577通過介導(dǎo)Notch信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥性[7]；miR-577作為抑癌基因通過阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化活性,從而抑制腫瘤發(fā)展[8]，表明miR-577參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是眾多腫瘤潛在治療靶點(diǎn)及其腫物標(biāo)志物之一?；谀壳坝嘘P(guān)miR-577在喉乳頭狀瘤中的作用研究尚未見研究報(bào)道，因此，本研究擬探討由外泌體介導(dǎo)的miR-577在幼兒復(fù)發(fā)性喉乳頭狀瘤中的表達(dá)及其對(duì)喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用及其可能潛在機(jī)制，以期為幼兒喉乳頭狀瘤的診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1幼兒喉乳頭狀瘤及正常喉組織標(biāo)本采集 收集2016年6月至2019年12月在湖南省兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科確診并行手術(shù)治療的30例幼兒喉乳頭狀瘤組織樣本及其相匹配且遠(yuǎn)離病灶并經(jīng)病理證實(shí)的正常喉組織樣本進(jìn)行研究，所有組織樣本于手術(shù)中獲取，離體后20 min內(nèi)行快速冰凍病理檢查確認(rèn)，后經(jīng)石蠟包埋制成組織標(biāo)本于低溫液氮中保存?zhèn)溆谩?0例喉乳頭狀瘤幼兒中，男13例，女17例，年齡6～57個(gè)月，平均24.3±6.5個(gè)月。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)材料、試劑、儀器 人正常喉上皮細(xì)胞株和喉乳頭狀瘤細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。研究所用miR-577從喉乳頭狀瘤細(xì)胞分泌的外泌體中分離獲得；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國(guó)HyClone公司；Transwell小室購自美國(guó)Corning公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自美國(guó)Promega公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠Notch、兔抗鼠DSL、兔抗鼠MMP-9、兔抗鼠MMP-1和鼠抗GAPDH購自美國(guó)Abcam公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購自美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物、NC mimic和miR-577 mimic模擬物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成。

1.3研究方法

1.3.1正常喉上皮細(xì)胞和喉乳頭狀瘤細(xì)胞培養(yǎng) 將正常喉上皮細(xì)胞和喉乳頭狀瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清及雙抗)，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天換液，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2喉乳頭狀瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)合成PCR引物，擴(kuò)增目的基因全長(zhǎng)。待喉乳頭狀瘤細(xì)胞培養(yǎng)融合度達(dá)90%時(shí)，按照Lipofectamine 3000說明書將miR-577 mimic以及陰性對(duì)照NC mimic分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，并設(shè)置空白對(duì)照，依次設(shè)為miR-577過表達(dá)組(miR-577 mimic組)、陰性對(duì)照組(NC mimic組)和空白對(duì)照組(control組)，置于37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)孵育48 h后檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)喉乳頭狀瘤組織及細(xì)胞中miR-577相對(duì)表達(dá) 采用Trizol法提取喉乳頭狀瘤組織及細(xì)胞的總RNA并測(cè)量其濃度和純度；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板按照qRT-PCR試劑盒說明書行PCR反應(yīng)。引物序列miR-577正向：5’-ACGTTAGCTACACTTGCGTT-3’，反向：5’-AGTGCCGTTGCATACAAAGG-3’；β-actin正向：5’-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3’，反向：5’- AGGAATCCTTCTGACCACTGC -3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃退火30 s,60 ℃延伸90 s，擴(kuò)增循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-577與Notch的靶向關(guān)系 通過TargetScan(http://www.targetscan.org/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-577的靶基因，發(fā)現(xiàn)Notch的3’-UTR區(qū)與miR-577存在結(jié)合位點(diǎn)，可能是miR-577的靶基因。利用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，通過擴(kuò)增Notch基因3’-UTR片段，構(gòu)建包含miR-577與Notch結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的野生型(WT)及突變型(MUT)雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體(pcDNA3.1-Notch)；利用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-577 mimics或NC mimic與pcDNA3.1-Notch載體WT型或MUT型共轉(zhuǎn)染至喉乳頭狀瘤細(xì)胞中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.5CCK-8法檢測(cè)喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各轉(zhuǎn)染組喉乳頭狀瘤細(xì)胞，以6×103個(gè)/孔密度接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔；向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育24 h后使用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量吸光度(OD)值，OD值越高表明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.6Tanswell法檢測(cè)喉乳頭狀瘤細(xì)胞侵襲 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各轉(zhuǎn)染組喉乳頭狀瘤細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；消化、離心細(xì)胞后按照2×104個(gè)/毫升用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；按照每孔200 μl將細(xì)胞懸液加入transwell小室，同時(shí)在transwell下室加入10%TBS和500 μl培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在上室中加入結(jié)晶紫染液，5 min后回收染液；在正置顯微鏡上放置一塊載玻片，將transwell小孔倒置放在上面，拍照；在100倍視野下行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲率，計(jì)數(shù)越多表明細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.7Western blot檢測(cè)Notch、DSL、MMP-1、MMP-9蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期喉乳頭狀瘤細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48 h后收集各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清，采用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；室溫下以含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉PVDF膜1 h，分別加入Notch、DSL一抗孵育，4 ℃過夜；TBST清洗膜8 min，重復(fù)4次，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；TBST重復(fù)清洗膜4次，ECL發(fā)光液顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中采用Quantity-One 軟件分析蛋白含量，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染組、多組間比較采用單因素方差(ANOVA)分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；喉乳頭狀瘤組織和配對(duì)的正常喉組織中表達(dá)差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)；喉乳頭狀瘤細(xì)胞及正常喉上皮細(xì)胞中表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1喉乳頭狀瘤組織及細(xì)胞中miR-577表達(dá) qRT-PCR法檢測(cè)顯示，喉乳頭狀瘤組織中miR-577 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.134±0.026)顯著低于正常喉組織(0.823±0.056)(t=61.123,P<0.001)；喉乳頭狀瘤細(xì)胞中miR-577 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.256±0.026)顯著低于正常喉上皮細(xì)胞(0.962±0.072)(t=15.974,P<0.001);表明喉乳頭狀瘤中miR-577顯著低表達(dá)。

2.2過表達(dá)miR-577對(duì)喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響 在喉乳頭狀瘤細(xì)胞的control、NC mimic和miR-577 mimic組細(xì)胞中miR-577相對(duì)表達(dá)水平分別為0.965±0.005、1.012±0.094、4.026±0.298，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=283.461，P<0.001)；與control組相比，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后喉乳頭狀瘤細(xì)胞中miR-577相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.001)，而control、NC mimic組中miR-577相對(duì)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1a)，提示miR-577過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

CCK-8 法檢測(cè)miR-577對(duì)喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖的影響見表1、圖1b，可見與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后48、72 h喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖能力明顯降低(P<0.01)。tanswell實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)miR-577對(duì)喉乳頭狀瘤細(xì)胞侵襲能力及侵襲相關(guān)蛋白MMP-1、MMP-9表達(dá)的影響見表2、圖1a～d,可見，與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后喉乳頭狀瘤細(xì)胞侵襲率及MMP-1、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，提示miR-577過表達(dá)抑制喉乳頭狀瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

表1 NC mimic組與miR-577 mimic組喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖能力(OD值)比較

表2 NC mimic組與miR-577 mimic組喉乳頭狀瘤細(xì)胞侵襲率及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.3miR-577靶向結(jié)合Notch Starbase軟件預(yù)測(cè)顯示miR-577與Notch的3'UTR區(qū)序列存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2a)，通過構(gòu)建包含兩者結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的Notch野生型(WT-Notch)和突變型(Mut-Notch)熒光素酶報(bào)告載體，進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后WT-Notch組相對(duì)熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic對(duì)MUT-Notch組熒光素酶活性無影響(圖2b);提示Notch是miR-577的靶基因，喉乳頭狀瘤細(xì)胞中miR-577與Notch通路可能存在一定關(guān)聯(lián)。

為明確miR-577與Notch通路的關(guān)系，qRT-PCR法檢測(cè)顯示，喉乳頭狀瘤細(xì)胞中Notch、DSL mRNA表達(dá)顯著高于正常喉上皮細(xì)胞(P<0.05)(表3)。Western blot進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后喉乳頭狀瘤細(xì)胞中Notch(1.012±0.014)、DSL(0.768±0.016)蛋白表達(dá)較NC mimic組(分別為2.498±0.286、2.221±0.259)明顯降低(分別為t=8.989，P<0.01；t=9.699，P<0.01)(圖2c),證明miR-577可通過直接結(jié)合與Notch的3'UTR區(qū)結(jié)合進(jìn)而抑制Notch通路。

表3 喉乳頭狀瘤細(xì)胞和正常喉上皮細(xì)胞中Notch、DSL mRNA表達(dá)

2.4miR-577調(diào)控Notch通路抑制細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch后采用CCK-8法、tanswell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)，可見與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-577 mimic后喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞侵襲率明顯降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch后細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞侵襲率較單純轉(zhuǎn)染miR-577 mimic組明顯增加(P<0.05)(表4)，提示共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch可逆轉(zhuǎn)miR-577 mimic對(duì)喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用，表明Notch是miR-577的一個(gè)重要靶點(diǎn)，miR-577可能通過調(diào)控Notch通路抑制喉乳頭狀瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

表4 Control組、NC mimic組、miR-577 mimic組和miR-577 mimic+Notch組喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖(OD值)、侵襲率比較

3 討論

雖然喉乳頭狀瘤在組織學(xué)上是良性腫瘤，但其具有多發(fā)性、易復(fù)發(fā)等特征，易造成呼吸道梗阻，多次手術(shù)可引起喉狹窄和發(fā)聲障礙，給患者及其家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。特別是近年來隨著性病和傳染性疾病的增多，小兒喉乳頭狀瘤有明顯增多的趨勢(shì)，故基于分子生物學(xué)角度探討喉乳頭狀瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，找尋特異性分子靶標(biāo)，對(duì)其臨床治療具有重要意義。

外泌體(exosome)是一類由細(xì)胞分泌的功能性囊泡結(jié)構(gòu)，具有廣泛的內(nèi)容物，其可誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生大量生物學(xué)過程，參與多種生物病理過程，誘導(dǎo)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞耐藥[3]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體參與多種類型腫瘤細(xì)胞間通訊、細(xì)胞耐藥、微環(huán)境調(diào)節(jié)等，其攜帶的致癌轉(zhuǎn)錄因子、致癌mRNAs等參與腫瘤不同階段的發(fā)展[9]，而腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中某些特異性成分可作為多種腫瘤潛在的診斷及預(yù)后標(biāo)志物[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與周圍組織進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)及內(nèi)容物傳遞，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，證實(shí)多種細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體，參與細(xì)胞抗原提呈及腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。外泌體中攜帶的miRNAs作為轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平的基因組阻滯物抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)mRNA降解，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[11]。據(jù)報(bào)道，由外泌體介導(dǎo)的miRNA異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]，即有些miRNA表現(xiàn)出促癌作用，如：miR-125-3p、miR-21-3a以及miR-146a等，而有些miRNA則表現(xiàn)出抑癌作用，如：miR-192-5p、miR-577等[13]。miR-577在多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)量下調(diào)，作為多種惡性腫瘤的抑癌因子，參與多種惡性腫瘤的生物學(xué)過程，發(fā)揮抑癌作用[14]。此外，miR-577在其他癌癥的發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用。例如，miR-577在肝癌組織中低表達(dá)，與惡性臨床病理特征有關(guān)，其通過抑制Wnt信號(hào)通路可抑制肝癌的生長(zhǎng)[15]。miR-577可抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[16]。miR-577通過靶向Rab25抑制乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[17]。因此，研究推測(cè)miR-577在幼兒喉乳頭狀瘤的發(fā)生發(fā)展中也存在某種重要作用。從本研究結(jié)果看，miR-577在幼兒喉乳頭狀瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于正常喉組織和正常喉上皮細(xì)胞；過表達(dá)miR-577顯著抑制喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖和侵襲，并抑制侵襲相關(guān)蛋白MMP-1和MMP-9表達(dá)，提示miR-577在喉乳頭狀瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用。

癌癥的發(fā)生發(fā)展離不開眾多信號(hào)通路的調(diào)控，Notch通路是腫瘤微環(huán)境中最重要的通路之一。Notch信號(hào)通路由Notch配體和受體構(gòu)成，其兩者結(jié)合導(dǎo)致蛋白水解并釋放Notch1激活的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及靶蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為[18]?，F(xiàn)階段眾多研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路的異常表達(dá)或失調(diào)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等過程及細(xì)胞耐藥密切相關(guān)，并證實(shí)Notch信號(hào)通路表達(dá)異常是重要的促癌、抑癌因素[19～21]。袁勇等[22]研究表明，Notch2作為Notch通路主要成員在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等過程。Yen等[23]研究表明，抗Notch2/3減弱Notch信號(hào)通路表達(dá)進(jìn)而減弱了腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡能力。骨肉瘤組織及細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)因子Hes-1異常表達(dá)，高侵襲性骨肉瘤細(xì)胞株中Notch信號(hào)活性明顯增高[24];且Notch信號(hào)失調(diào)存在于乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等惡性腫瘤中，Notch信號(hào)通路的激活是導(dǎo)致眾多腫瘤患者預(yù)后不良的主要原因之一[25,26]。因此，為明確miR-577影響喉乳頭狀瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在作用機(jī)制，本研究通過檢索生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-577與Notch的3'UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步通過雙熒光素基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)miR-577過表達(dá)顯著降低野生型Notch的熒光素酶活性，提示Notch是miR-577的一個(gè)靶基因；文中檢測(cè)結(jié)果顯示miR-577過表達(dá)顯著抑制Notch通路相關(guān)蛋白Notch、DSL表達(dá)水平，提示miR-577通過直接與Notch-3'UTR區(qū)結(jié)合可抑制Notch通路。此外，文中結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染miR-577 mimic的細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch，可見喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力較單純轉(zhuǎn)染miR-577 mimic組明顯增高，提示共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Notch逆轉(zhuǎn)了miR-577 mimic對(duì)喉乳頭狀瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的抑制作用，說明Notch是miR-577的一個(gè)重要靶點(diǎn)，miR-577可能通過介導(dǎo)Notch通路抑制喉乳頭狀瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，但其更深入的分子機(jī)制還需繼續(xù)研究。

綜上所述，幼兒喉乳頭狀瘤組織及喉乳頭狀瘤細(xì)胞中 miR-577顯著低表達(dá)，過表達(dá)miR-577顯著抑制喉乳頭狀瘤細(xì)胞的增殖和侵襲；Notch是miR-577的潛在靶點(diǎn)，miR-577可能通過與Notch的3'UTR區(qū)結(jié)合進(jìn)而調(diào)控Notch信號(hào)通路來抑制喉乳頭狀瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。