盛?，摚跚镤J，尉 靜，關(guān)秀娟，趙利霞，左艷萍*

(1.北京市通州區(qū)新華醫(yī)院口腔正畸科，北京 101100；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔正畸科，河北 石家莊 050031)

功能性下頜前伸后髁突后部軟骨細(xì)胞增殖，但軟骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不明確。已證實(shí)下頜骨髁狀突骨改建受多種內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子的影響，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、X型膠原Sox-9、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、核因子κB 受體活化因子配基、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP) -2 、MMP-9、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1、整合素β等[1-3]。這些調(diào)控因子并不是獨(dú)立存在的，而是與組織細(xì)胞內(nèi)許多相關(guān)因子聯(lián)合發(fā)揮作用，其中血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)是細(xì)胞膜上的大分子跨膜蛋白，能接收外界信號，其下游的信號因子磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1，PLC-γ1)在腫瘤細(xì)胞、卵母細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞等細(xì)胞的分裂增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,因此，PLC-γ1在許多疾病臨床治療中成為重要靶點(diǎn)[4-8]。那么PLC-γ1是否對軟骨細(xì)胞分裂、增殖有調(diào)控作用呢？其在下頜功能性前伸后髁突軟骨骨化過程中扮演了一個什么角色？本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測PLC-γ1在大鼠功能性下頜前伸前后髁突軟骨后部表達(dá)水平的變化，探討 PLC-γ1在功能性下頜前伸后大鼠髁突后部軟骨骨化過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 60只4周齡健康雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，平均體重90 g。于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(室溫約26 ℃)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)等量分為2組，實(shí)驗(yàn)組大鼠24 h/d佩戴自制斜面導(dǎo)板矯治器，對照組不作任何處理。于實(shí)驗(yàn)第1、3、7、14、21、28 天時2組采用斷頸法各處死5只。

1.2組織處理 大鼠處死后，盡快取出雙側(cè)整塊顳下頜關(guān)節(jié)，注意避免損傷關(guān)節(jié)囊。4%多聚甲醛 (0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6，含0.1%焦磷酸二乙酯)固定24 h，10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)室溫脫鈣2周(用大頭針針刺組織無阻力進(jìn)入表示脫鈣成功)，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，包埋時盡量保證髁突矢狀面與蠟塊表面平行。髁突縱向切片，厚度約5 μm，將組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃過夜。

1.2.1HE染色 切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精下行水化，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，1/500氨水中返藍(lán)，0.5%伊紅染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2免疫組織化學(xué)分析 切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇置換二甲苯，1%甲醇過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。棄去多余液體,不洗。滴加一抗 (anti-PhosPho-PLC-γ1，兔多抗，assay公司，美國)，4 ℃過夜。按免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)要求滴加生物素化第二抗體(IgG)， 37 ℃ 20 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS沖洗。3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核?？瞻讓φ眨篜BS代替一抗。

1.3圖像分析 應(yīng)用光學(xué)顯微鏡(BX51TPHD-J11，奧林巴斯公司，日本)多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)采集40倍及400倍HE染色切片圖像，對髁突軟骨后部免疫組織化學(xué)染色切片，隨機(jī)選擇3個視野，采集400倍圖像，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度，取平均值，結(jié)果用強(qiáng)度-色調(diào)-飽和度(intensity-hue-saturation，IHS)值表示，計(jì)算公式為IHS=A×B。其中A表示陽性細(xì)胞數(shù)，取值范圍：0為0%，1為1%～10%,2為11%～50%，3為51%～80%，4為81%～100%；B表示著色強(qiáng)度，0為陰性，1為弱陽性，2為陽性，3為強(qiáng)陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，時點(diǎn)間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 髁突軟骨厚度由后向前逐漸變薄，從軟骨表面向內(nèi)部分為5層，分別是表面纖維層、增殖層、過渡層、肥大層、鈣化軟骨層，各層細(xì)胞形態(tài)特征不同，層帶之間相互延續(xù)，軟骨下方為骨小梁，與軟骨的鈣化軟骨層相延續(xù)(圖1，2)。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PLC-γ1表現(xiàn)為陽性著色，DAB顯色棕黃色，著色水平明顯高于背景水平，主要表達(dá)于髁突軟骨的增殖層和過渡層。實(shí)驗(yàn)組第14天時表達(dá)最強(qiáng)(圖3～6)。 空白對照組：PBS代替一抗組細(xì)胞質(zhì)未見陽性著色顆粒(圖7)。

2.3IHS值統(tǒng)計(jì)結(jié)果 第7、14、21、28 天時實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨后部PLC-γ1表達(dá)的IHS值高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組不同時間點(diǎn)PLC-γ1表達(dá)的IHS值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組大鼠髁突軟骨后部PLC-γ1表達(dá)情況(IHS值)比較Table 1 The PLC-γ1 expression(IHS value) in the posterior condylar cartilage between two groups

Figure 2 The morphological characteristics of condyle cartilage of rats (×400)

3 討 論

本研究HE染色結(jié)果顯示，髁突軟骨后部增厚明顯，由后向前髁突軟骨厚度逐漸變薄，提示髁突后部發(fā)生了較為明顯的骨改建，與前人實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[9-10]，因此選擇髁突軟骨后部進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色研究。

目前研究發(fā)現(xiàn)，PLC-γ1上游信號因子之一是VEGF及其受體VEGFR-2，早期研究發(fā)現(xiàn)VEGF是一種內(nèi)皮系統(tǒng)組織細(xì)胞的特異性因子，在動物胚胎期血管發(fā)生過程中起著重要作用[11]?，F(xiàn)研究證實(shí)，非內(nèi)皮系統(tǒng)組織中也廣泛存在VEGF，VEGF與骨形成蛋白具有相似的功能，在軟骨成骨過程中協(xié)調(diào)著軟骨細(xì)胞增殖與骨形成之間的關(guān)系，在軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換為骨細(xì)胞的過程中起著重要作用[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在小鼠軟骨骨化的早期和晚期都發(fā)揮了重要作用，將小鼠VEGF基因敲除后其軟骨骨化過程受阻[15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及其受體VEGFR-2在髁突軟骨的骨改建過程中同樣發(fā)揮著不可或缺的作，有學(xué)者在大鼠髁突和顳骨關(guān)節(jié)窩中檢測到了VEGF，提出骨取代軟骨的標(biāo)志是軟骨細(xì)胞表達(dá)VEGF刺激新生血管形成，VEGF是連接血管和新骨形成的重要因子[16]。將生長發(fā)育期SD大鼠采用功能矯治器導(dǎo)致下頜前伸后可刺激髁突軟骨發(fā)生適應(yīng)性改建，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖活性，使其分化加速，VEGFR-2作為 VEGF 的特異性受體，介導(dǎo)了 VEGF生物學(xué)作用，參與了大鼠髁突軟骨的骨改建[17]。髁突軟骨細(xì)胞分泌VEGF有的通過自分泌方式，有的通過旁分泌方式，VEGF與其受體VEGFR-2作用誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大層內(nèi)的血管化進(jìn)程，促進(jìn)軟骨骨化[18]。

哺乳動物體內(nèi)廣泛存在PLC-γ1，其一般位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時PLC-γ1通常維持在一定水平，而當(dāng)機(jī)體組織接收到外界刺激，例如細(xì)胞內(nèi)的大分子調(diào)控因子VEGF將外界刺激信號進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞內(nèi)，接收到上一級信號刺激后，PLC-γ1的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)被激活，從而促進(jìn)組織細(xì)胞的分裂、增殖、分化等過程[14，19]。其具體過程如下：VEGF接收到外界信號刺激后，進(jìn)一步作用于細(xì)胞膜上的受體VEGFR-2，將細(xì)胞膜上受體蛋白的酪氨酸殘基激活，而這些受體又具有酪氨酸激酶活性，當(dāng)PLC-γ1 與活化的生長因子受體結(jié)合后，受體本身的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)發(fā)生自動磷酸化后被激活，與胞內(nèi)PLC-γ1的SH2、SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合并將其酪氨酸殘基激活，從而進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)一系列下游信號傳導(dǎo)通路。PLC-γ1的SH2與PTK結(jié)合后，作用于細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇4，5二磷酸并將其分解為二酰甘油(diacylglycerol,DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)。DAG可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，IP3可引起細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子，最終完成細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞，引發(fā)細(xì)胞的增殖與分化[20]。VEGFR2是VEGF的主要功能受體,已有5個主要的磷酸化位點(diǎn)被證實(shí)，其中Tyr-1175、Tyr-801是PLC-γ1結(jié)合位點(diǎn)[21]。PLC-γ1-Tyr783的磷酸化激活PLC-γ1的活性，在調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管新生方面發(fā)揮了重要作用。胚胎期動脈血管的發(fā)生即通過VEGFR2的Tyr-1175被激活后,進(jìn)一步激活胞內(nèi)的PLC-γ1來完成[22]。Husain等[23]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR-2能夠通過PLC-γ1 信號的活化促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖效應(yīng)。

VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1信號鏈在血管生成過程中發(fā)揮了重要作用,那么該信號鏈?zhǔn)欠裨谙骂M髁突前伸后軟骨骨化過程中同樣發(fā)揮作用？本研究結(jié)果顯示，第7、14、21、28 天時實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨后部PLC-γ1表達(dá)的IHS值高于對照組，與前人關(guān)于VEGF及其受體VEGFR-2在大鼠功能性下頜前伸后髁突軟骨后部的表達(dá)變化規(guī)律具有一致性[24]。已經(jīng)證實(shí)VEGF在大鼠下頜功能前伸后髁突軟骨后部軟骨成骨過程中發(fā)揮了一定作用[25]，因此，推測VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1這條信號通路在功能性下頜前伸大鼠髁突軟骨骨化過程中發(fā)揮了一定作用。

下頜功能前伸后髁突軟骨改建是個復(fù)雜的過程，PLC-γ1和VEGF在軟骨骨化過程中具體機(jī)制尚未明確，本研究僅通過PLC-γ1的表達(dá)情況與前人關(guān)于VEGF及其受體VEGFR-2的表達(dá)具有一致性來推測該信號鏈在大鼠下頜功能前伸后髁突軟骨骨化過程中發(fā)揮作用尚不全面，這是本研究的不足之處，如引入PLC-γ1及VEGF的抑制劑從對立面進(jìn)一步證實(shí)則可信度更高。但可以肯定的是PLC-γ1是眾多細(xì)胞因子信號途徑的交匯，在組織反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中是一個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，PLC-γ1可能參與了下頜功能性前伸大鼠髁突軟骨骨化的過程，對其水平進(jìn)行檢測對髁突部軟骨骨化的研究具有重要參考價值，相信其在口腔領(lǐng)域也將會為功能矯治骨骼改建靶點(diǎn)選擇提供參考。