梁俊輝 陳澤銳 彭樹明 陳善嘉 舒柏榮

目前肝細(xì)胞癌（肝癌）是病死率較高的惡性腫瘤之一。盡管近年肝癌的基礎(chǔ)和臨床研究取得較大進(jìn)展，但肝癌患者的5 年生存率仍然很低。現(xiàn)有的多種療法依然具有明顯不良反應(yīng)。尋找早期診斷的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點，對改善肝癌患者的預(yù)后是十分必要的。果蠅胚胎中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子叉頭框蛋白（FOX）在控制細(xì)胞周期、上皮分化和代謝以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等許多生物學(xué)過程中有重要的作用，且具有腫瘤抑制和潛在致癌的雙重作用。FOXB2 是FOX 蛋白家族的重要成員之一，研究顯示FOXB2 抑制了胰腺癌細(xì)胞Panc-1的惡性表型。FOXB2 在肝癌中的作用筆者尚未見有相關(guān)報道，為此進(jìn)行本研究，旨在闡明FOXB2在肝癌中的作用。

材料與方法

一、試劑與耗材

胎牛血清（FBS）、雙抗抗生素、高糖DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛；細(xì)胞培養(yǎng)板（6、24、96 孔板）、Transwell 小室（8 μm）購自Corning 公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、增強型電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus 試劑、TB Green逆轉(zhuǎn)錄快速熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑購自寶生物工程有限公司；FOXB2 抗體購自Immunoway 公司；GAPDH抗體購自Santa Cruz Biotechnology；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購自北京銳抗生物科技有限公司；0.22 μm 的聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自Millipore 公司；結(jié)晶紫購自Sigma-Aldrich 公司。

二、方 法

正常肝細(xì)胞LO2 細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)細(xì)胞，添加10 000 kU/L 的鏈霉素和10 000 kU/L 青霉素于培養(yǎng)基中。于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至90%時進(jìn)行傳代，隔日進(jìn)行細(xì)胞換液。

按照說明書應(yīng)用RNAiso Plus 試劑從細(xì)胞中獲取總RNA，NanoDrop 測定RNA 濃度。RT 體系為10 μL，模板DNA 產(chǎn)物常規(guī)稀釋10 倍；采用TB GreenFast qPCR Mix 試劑進(jìn)行qRT-PCR 檢測mRNA 的表達(dá)水平。引物由華大基因合成。引物序列：GAPDH 上游5’-CTACACTGAGCACCAGGTG GTC-3’，下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG-3’，產(chǎn)物長度115 bp；FOXB2上游5’-GCTGAGCG ACATCTACAAGTTC-3’，下 游5’-GAATCTTGATG AAGCAGTCGTTG-3’，產(chǎn)物長度119 bp。2法計算目的mRNA 相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3 次。

轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的Huh7 細(xì)胞為Vector 組，轉(zhuǎn)染FOXB2 重組質(zhì)粒的Huh7 細(xì)胞為FOXB2組；細(xì)胞轉(zhuǎn)染的前一日，消化收集細(xì)胞，計數(shù)后鋪于24 孔板；細(xì)胞轉(zhuǎn)染當(dāng)日，取Opti-MEM 稀釋質(zhì)粒；加入Lipofectamine 3000，培養(yǎng)20 min；取Lipofectamine 3000 在Opti-MEM 中 稀 釋；將 混 合液加入對應(yīng)各孔中后搖勻；繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后檢測FOXB2 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平。

預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞15 min。BCA 法測定蛋白濃度。95℃變性5 min，10%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白質(zhì)，0.22 μm PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，抗體（FOXB2 1∶1000；GAPDH 1∶1000）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3 次，每次8 min，抗體室溫孵育2 h；TBST洗滌3 次，每次8 min，使用增強ECL 底物在BIO-RAD Chemidoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)曝光；使用Image J 進(jìn)行圖像分析。

96 孔板每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液（含有5×10個細(xì)胞），每組3 個復(fù)孔，不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對照（Vector）；然后分別于預(yù)先制定好的檢測時間點（24、48、72 h），向檢測孔中加入10 μL 的CCK-8 試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀上在450 nm 處測定吸光度（D）。實驗重復(fù)3 次。

取Vector 對照組和FOXB2 過表達(dá)組的細(xì)胞以1×10/孔的密度鋪板6 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)1 周，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后用0.2%結(jié)晶紫染色，相機拍照并計數(shù)克隆個數(shù)。實驗重復(fù)3 次。

按試劑盒說明書將5×10細(xì)胞接種在24 孔板中。預(yù)定時間收集細(xì)胞并將其懸浮在無血清培養(yǎng)基中。遷移能力時將細(xì)胞置于未涂Matrigel 膠的上腔室中。侵襲實驗測定時將上室的膜按1∶8 稀釋并涂Matrigel 膠。所有下腔室均充滿500 μL 含25%FBS 的培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于上室培養(yǎng)24 h 后，在200 倍物鏡下使用顯微鏡在3 個視野中對遷移或侵襲的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7 處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以表示，2 組比較采用t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、LO2、Hep3B、Huh7 細(xì) 胞 中FOXB2 mRNA 相對表達(dá)量比較

人肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7 細(xì)胞的FOXB2 mRNA 表達(dá)水平低于人正常肝細(xì)胞LO2 細(xì)胞（F=321.6，P ＜ 0.001），見圖1。

圖1 LO2、Hep3B、Huh7 細(xì)胞中FOXB2 mRNA 相對表達(dá)量比較

二、FOXB2 過表達(dá)對Huh7 細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后的qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與Vector組細(xì)胞相比，F(xiàn)OXB2 組細(xì)胞的FOXB2 mRNA（t=21.85，P ＜ 0.001）和蛋白（t=7.19，P=0.002）相對表達(dá)量均明顯上調(diào)，見圖2A～C。CCK-8 實驗顯示，過表達(dá)FOXB2 在72 h 明顯抑制了Huh7 細(xì)胞的增殖能力（t=5.61，P=0.005），見圖2D。

圖2 FOXB2 過表達(dá)效率驗證及其對Huh7 細(xì)胞增殖的影響

三、FOXB2 過表達(dá)對Huh7 細(xì)胞克隆形成的影響

平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)FOXB2明顯抑制了Huh7 細(xì)胞的克隆形成能力（t=19.41，P ＜ 0.001），見圖3。

圖3 FOXB2 過表達(dá)對Huh7 細(xì)胞克隆形成的影響

四、FOXB2 過表達(dá)對Huh7 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell 遷移實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)FOXB2明顯抑制了肝癌細(xì)胞Huh7 的遷移（t=7.32，P=0.002）和侵襲（t=10.58，P ＜ 0.001）能力，見圖4。

圖4 FOXB2 過表達(dá)對Huh7 細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色,×200）

討 論

肝癌仍然是危害人類健康的公共衛(wèi)生難題之一，在全球范圍內(nèi)仍然有增加的趨勢。盡管近年肝癌的診斷和治療研究方面均取得了長足的進(jìn)展，但其5 年生存率仍然較低，主要原因為肝癌早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，大部分肝癌患者在確診時已處于中晚期，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移及相關(guān)并發(fā)癥是造成肝癌患者死亡的主要原因。肝癌患者根治性切除術(shù)后5 年累積復(fù)發(fā)率約為70%，有大約90%的患者因發(fā)生轉(zhuǎn)移而死亡。因此，深入研究肝癌的具體分子機制仍然是該領(lǐng)域的重點。

FOX 蛋白家族由一組進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄因子組成，其特征是一個共同的DNA 結(jié)合域，稱為叉頭盒結(jié)構(gòu)域。該家族包括19 個亞族，具有翼狀螺旋DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域或稱叉頭結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制作用，使FOX 具有腫瘤抑制和潛在致癌的雙重作用。FOX 蛋白家族參與細(xì)胞生長、分化和其他生物過程。FOX 蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子的解除調(diào)控對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。在人類中，根據(jù)序列相似性，F(xiàn)OX 基因被分為19 個亞組。在癌細(xì)胞中，許多FOX 基因被認(rèn)為是抑癌基因或促癌基因。例如，F(xiàn)OXO 和FOXM1轉(zhuǎn)錄因子的平衡通過競爭性調(diào)節(jié)靶基因胰島素樣生長因子，整合了腺苷5’-磷酸腺苷，活化蛋白激酶介導(dǎo)的代謝和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。FOXK1 和FOXK2在調(diào)節(jié)線粒體功能、代謝和凋亡中起重要作用。作為FOX 家族蛋白的一員，BRAF 突變陽性的結(jié)直腸癌中FOXB2 的5’區(qū)CpG 島存在異常甲基化。Fukuchi 等研究顯示，F(xiàn)OXB2 在胰腺癌細(xì)胞系Panc-1 細(xì)胞中低表達(dá)，其5’端的CpG 島高度甲基化，表明FOXB2 可能受到抑制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FOXB2 抑制了Panc-1 細(xì)胞的惡性特征。

本研究顯示，與正常肝細(xì)胞相比，F(xiàn)OXB2 在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)；過表達(dá)FOXB2 抑制了肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，同時降低了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究初步探討了FOXB2 在肝癌中的作用，為后續(xù)的研究奠定了一定的基礎(chǔ)，但FOXB2 在肝癌中的具體作用機制依然不明確，日后將進(jìn)一步研究FOXB2 在肝癌中的具體分子機制。為改善肝癌患者的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)新的肝癌藥物干預(yù)靶點提供理論依據(jù)。