何亮銀，周逢芳，史曉麗，黃偉卿，阮俊峰，田文貞，李進(jìn)壽

( 寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100 )

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國(guó)重要海水經(jīng)濟(jì)魚類，主要分布于東海和黃海南部，以及南海雷州半島東側(cè)近海水域[1]。據(jù)中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，2019年大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為225 549 t，已連續(xù)多年位居我國(guó)海水養(yǎng)殖魚類之首[2]。近年來(lái)，由于大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度過(guò)高，水體流通不暢，導(dǎo)致水體環(huán)境日益惡劣，病害嚴(yán)重，較易多發(fā)的有刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)病、水霉病、內(nèi)臟白點(diǎn)病、腸炎病、爛尾病及弧菌病等，造成大黃魚養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。有效控制各種病原感染已成為大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的迫切要求，通過(guò)水產(chǎn)病原疫苗防治病害被廣泛認(rèn)為是一種綠色健康、安全有效的可行途徑[4]。一種疫苗研制的方法是將滅活的病原菌按標(biāo)準(zhǔn)免疫流程注射到小鼠、家兔等試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，免疫周期結(jié)束后獲取抗血清，以免疫印跡結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜鑒定免疫原性蛋白，并進(jìn)一步開發(fā)為亞單位疫苗或基因工程疫苗[5]。筆者通過(guò)對(duì)引起寧德三都澳海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚患病的病原進(jìn)行分離、鑒定，明確病原的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、理化性質(zhì)及16S rDNA序列信息，為病原菌的生物學(xué)特性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；通過(guò)制備病原菌的鼠源多克隆抗體，為病原菌的免疫原性分析及后續(xù)免疫防治打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

瀕死患病10月齡大黃魚取自寧德三都澳海域養(yǎng)殖網(wǎng)箱，發(fā)病水溫約25 ℃。感染初期，病魚不攝食，體色變暗；感染后期，病魚頭部及腹部有出血點(diǎn)，腹部微腫脹，逐漸死亡。用于人工感染試驗(yàn)的健康大黃魚購(gòu)自寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司，體長(zhǎng)(15.0±1.5) cm，體質(zhì)量(46.4±3.5) g。用于多克隆抗體制備的Balb/c小鼠購(gòu)自吳氏試驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2 主要試劑與儀器

用于病原菌分離與培養(yǎng)的LB肉湯、LB瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA聚合酶等分子生物學(xué)相關(guān)試劑購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，用于病原菌生理生化特性分析的VITEK細(xì)菌鑒定卡購(gòu)于法國(guó)梅里埃公司。

試驗(yàn)主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、核酸電泳系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)、PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(法國(guó)梅里埃公司)、全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電公司)。

1.3 優(yōu)勢(shì)菌株的分離

選取患病瀕死大黃魚，用75%乙醇棉球?qū)Σ◆~體表進(jìn)行擦拭消毒，無(wú)菌條件下解剖，可見病魚有輕微腹水，肝臟腫大，顏色較深，腸道輕度充血。挑取肝臟組織劃線接種于LB瓊脂上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)較為一致，挑取若干個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行重復(fù)劃線分離純化3次，得到多株純化菌株，選取其中1株，定名為NDLc-P。

1.4 優(yōu)勢(shì)菌回歸感染

選取體質(zhì)量(46.4±3.5) g的健康大黃魚用于回歸感染試驗(yàn)，試驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖水溫為(25±1) ℃，每日換水1/3，持續(xù)充氧，隔日投喂飼料。優(yōu)勢(shì)菌NDLc-P接種于LB肉湯，28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后，8500 r/min(離心半徑587 mm，下同)離心5 min收集菌體，菌體經(jīng)無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)離心洗滌3次后，麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整密度為1.0×109cfu/mL，然后按10倍稀釋分別獲得1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103cfu/mL共7個(gè)試驗(yàn)密度。試驗(yàn)用魚共分8組，每組10尾，其中7組分別經(jīng)腹腔注射上述密度菌懸液0.2 mL，對(duì)照組注射等體積的無(wú)菌PBS。攻毒后10 d內(nèi)連續(xù)觀察并記錄魚體的發(fā)病與死亡情況。同時(shí)，隨機(jī)對(duì)死亡大黃魚及時(shí)剖檢，并進(jìn)行致病菌的再次分離與鑒定。

1.5 優(yōu)勢(shì)菌株的形態(tài)學(xué)觀察與生理生化特性分析

取LB瓊脂上分離培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌，革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。采用法國(guó)梅里埃(BioMerieux)公司的微量多項(xiàng)鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌生理生化特性進(jìn)行分析。挑取LB瓊脂上分離的優(yōu)勢(shì)菌，以生理鹽水配制成0.50～0.63麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海凑詹僮饕筮M(jìn)行系統(tǒng)裝載和數(shù)據(jù)讀取與分析。

1.6 優(yōu)勢(shì)菌16S rDNA基因序列分析

挑取分離純化的病原菌預(yù)混于無(wú)菌去離子水中，作為PCR反應(yīng)模板。參考文獻(xiàn)[6]合成細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)完畢取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收濃縮，連接至pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆后送福州博尚(尚辰)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)定的16S rDNA序列通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的Blast檢索系統(tǒng)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并從比對(duì)結(jié)果中選取其他相似度較高的菌株序列，使用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 優(yōu)勢(shì)菌鼠源多克隆抗體的制備

挑取LB瓊脂上分離的優(yōu)勢(shì)菌，接種至LB肉湯28 ℃培養(yǎng)24 h后，8500 r/min離心5 min收集菌體，無(wú)菌PBS洗滌3次，調(diào)整菌液密度為5×108cfu/mL后，加入終體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醛在4 ℃條件下振蕩滅活4 h，滅活菌體經(jīng)無(wú)菌PBS洗滌5次后再調(diào)整密度為5×108cfu/mL，取0.2 mL滅活菌液在無(wú)菌環(huán)境下涂布于LB肉湯瓊脂培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h，以驗(yàn)證菌體已被滅活。已經(jīng)滅活后的菌懸液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

滅活優(yōu)勢(shì)菌NDLc-P分4次免疫2只8～12周齡的Balb/c小鼠，具體免疫程序如下：基礎(chǔ)免疫，滅活菌懸液與弗氏完全佐劑1∶1(體積比)混勻至“油包水”狀態(tài)后，腹腔注射0.2 mL；2周后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，滅活細(xì)菌懸液與弗氏不完全佐劑1∶1(體積比)腹腔注射0.2 mL；第4周和第5周分別再加強(qiáng)免疫1次，尾靜脈注射不加佐劑的菌懸液0.2 mL；最后一次加強(qiáng)免疫后1周摘眼球一次性取血，全血室溫傾斜放置2 h后置于4 ℃過(guò)夜，次日3000 r/min、4 ℃離心10 min獲抗血清，后續(xù)試驗(yàn)將2只小鼠的抗血清混合使用。

1.8 鼠抗血清抗體特性分析

以0.05 mol/L PBS將滅活優(yōu)勢(shì)菌NDLc-P密度調(diào)整至1×108cfu/mL，按每孔100 μL加入96孔酶標(biāo)版，設(shè)置3個(gè)平行，4 ℃包被過(guò)夜；次日傾去包被液，含0.5%吐溫20的磷酸緩沖鹽溶液(PBST)洗滌3次后，加入含5%脫脂奶粉的PBST，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次后，每孔加入PBST稀釋成不同密度梯度的鼠抗血清100 μL，37 ℃孵育1 h；按上述步驟洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(sigma,1∶5000)100 μL，37 ℃孵育50 min；洗滌后加入TMB顯色液(碧云天)顯色至預(yù)期深淺后加入2 mol/L H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)量反應(yīng)液吸光值。判定P/N≥2.1時(shí)為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病癥觀察與優(yōu)勢(shì)菌的菌落特性

患病大黃魚體色變暗，眼睛、體表及胸鰭基部出血(圖1a)；解剖可見少量腹水，腸壁充血發(fā)炎，腸道充滿黃色黏液(圖1b)。光學(xué)顯微鏡下，優(yōu)勢(shì)菌為短桿狀，革蘭氏染色呈陰性。優(yōu)勢(shì)菌在LB平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后生長(zhǎng)良好，肉眼可見白色菌落，中央略凸起、邊緣較光滑、呈圓形。

圖1 患病大黃魚Fig.1 Symptoms of diseased large yellow croaker L. croceaa.眼睛、頭部及胸鰭基部出血；b.腸道充滿黃色黏液.a.bleeding from the eyes, head and pectoral fin base；b.the intestines are filled with yellow mucus.

2.2 優(yōu)勢(shì)菌的回歸感染及致病力分析

分離優(yōu)勢(shì)菌NDLc-P經(jīng)腹腔注射感染大黃魚后，高密度組(1.0×109、1.0×108、1.0×107cfu/mL注射組)試驗(yàn)魚在4～5 d開始出現(xiàn)死亡，在8～9 d累積死亡率達(dá)100%；中密度組(1.0×106、1.0×105cfu/mL注射組)試驗(yàn)魚開始出現(xiàn)死亡的時(shí)間推遲，且至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡率小于50%；低密度組(1.0×104、1.0×103cfu/mL注射組)無(wú)試驗(yàn)魚死亡(圖2)。死亡個(gè)體出現(xiàn)的癥狀與自然發(fā)病魚體相吻合，且從隨機(jī)挑選的發(fā)病大黃魚病灶處可再次分離得到大量細(xì)菌，各個(gè)菌落形態(tài)一致，與菌株NDLc-P相似，而對(duì)照組魚體未表現(xiàn)任何癥狀。對(duì)分離病原菌進(jìn)行16S rDNA基因序列分析，序列信息與NDLc-P完全一致，表明試驗(yàn)分離得到的優(yōu)勢(shì)菌即為大黃魚的致病菌。根據(jù)感染試驗(yàn)獲得的各密度組累積死亡率數(shù)據(jù)，按照改進(jìn)的寇氏法[7]，計(jì)算病原菌NDLc-P感染后7 d對(duì)體質(zhì)量(46.4±3.5) g的健康大黃魚的半數(shù)致死密度為3.98×107cfu/mL，表明該病原菌具有一定的致病力。

圖2 不同密度優(yōu)勢(shì)菌腹腔注射回歸感染大黃魚試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Artificial challenge of large yellow croaker L. crocea against various densities of the isolated strain NDLc-P

2.3 病原菌的生理生化特性分析

生理生化反應(yīng)顯示，菌株NDLc-P的β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、脂肪酶及酪氨酸芳胺酶等反應(yīng)呈陽(yáng)性；能利用D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露糖及D-甘露醇等，不能利用古老糖、D-塔格糖及D-山梨醇等，能生成H2S(表1)。根據(jù)測(cè)試的生理生化特性，VITEK 2 COMPACT系統(tǒng)鑒定病原菌為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，且置信度為“極好的鑒定”，正確概率達(dá)98%。

表1 病原菌的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the isolated pathogenic strain

2.4 16S rDNA基因序列分析及病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

直接以病原菌為模板，采用27F和1492R引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，目的片段單一、明亮，大小符合預(yù)期(圖3，泳道1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆后測(cè)序，堿基序列經(jīng)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心在線工具Nucleotide BLAST同源比對(duì)分析，該序列同嗜水氣單胞菌M_13(登錄號(hào)MG428903.1和H_23(MG428896.1)的16S rDNA基因序列同源性達(dá)99.87%。選取數(shù)據(jù)庫(kù)中與菌株NDLc-P的16S rDNA序列高度同源的其他14株單胞菌利用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株NDLc-P與嗜水氣單胞菌聚為一支，置信度為84%(圖4)。根據(jù)菌株NDLc-P的16S rDNA序列同源比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果，將其鑒定為嗜水氣單胞菌。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析病原菌16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 The agarose gel electrophoresis of gene amplification of 16S rDNA of the isolated strainM.DL 2000 marker；1.16S rDNA基因.M.DL 2000 marker；1.16S rDNA gene.

圖4 基于16S rDNA序列的菌株NDLc-P系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain NDLc-P based on 16S rDNA sequences

2.5 病原菌鼠源多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著鼠源抗血清稀釋倍數(shù)增加，P/N值逐漸降低，當(dāng)稀釋倍數(shù)小于40 000時(shí)，P/N>2.1，而當(dāng)稀釋倍數(shù)大于50 000時(shí)，P/N<2.1，表明試驗(yàn)制備的抗血清效價(jià)較高，達(dá)40 000(圖5)。

圖5 間接ELISA測(cè)定鼠抗血清效價(jià)Fig.5 Detection of the titers of mouse antisera against strain NDLc-P

3 討 論

3.1 水產(chǎn)病原的分離鑒定

病原的分離與鑒定是病原致病機(jī)理研究與病害防治的首要任務(wù)。微生物的種類不同，生命活動(dòng)與新陳代謝也不盡相同，利用微生物的代謝特征鑒定微生物種類是經(jīng)典方法之一。由于16S rDNA基因分子結(jié)構(gòu)上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息，使其成為一個(gè)較為理想的基因分類靶序列，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定中[8]。目前，在病原菌鑒定方面，研究人員廣泛采用結(jié)合形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)及16S rDNA序列等信息的方法，綜合判斷病原種類。沈錦玉等[9]通過(guò)16S rDNA分子鑒定了大黃魚低溫弧菌病病原為溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)；李忠琴等[10]通過(guò)對(duì)大黃魚分離菌的生理生化鑒定和擴(kuò)增其16S rDNA基因序列鑒定其為維氏氣單胞菌(A.veronii)；曹際等[11]通過(guò)對(duì)分離自患潰瘍病大黃魚肝臟中病原菌的生理生化特性及16S rDNA基因分析，鑒定病原為溶藻弧菌。本試驗(yàn)中，在對(duì)分離優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行回歸感染驗(yàn)證后，利用梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌的生理生化特性進(jìn)行了分析，系統(tǒng)判斷其為嗜水氣單胞菌，且正確概率達(dá)98%；對(duì)病原菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，與數(shù)據(jù)庫(kù)中嗜水氣單胞菌的同源性達(dá)99.87%，基于16S rDNA的病原菌進(jìn)化樹也顯示病原菌與嗜水氣單胞菌聚為一支。綜合病原菌的生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，確定NDLc-P為嗜水氣單胞菌。

3.2 嗜水氣單胞菌引起水產(chǎn)動(dòng)物病害

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體中，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，也是一種條件致病菌，是典型的人—獸—魚共患病病原菌[12-13]。該菌能引起軟體動(dòng)物、魚類、兩棲類、爬行類、鳥類及哺乳類等多種動(dòng)物全身性敗血癥或局部感染，并常致動(dòng)物死亡；引起人類急性胃腸炎、敗血癥及傷口感染[14]。嗜水氣單胞菌能引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害，如錦鯉(Cyprinuscarpio)[15]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[16]、青魚(Mylopharyngodpiceus)[17]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[18]等，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌能感染大黃魚，引起體表和內(nèi)臟出血，導(dǎo)致魚體死亡[19-20]。筆者從患病網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚內(nèi)臟組織分離到嗜水氣單胞菌NDLc-P，大黃魚回歸感染試驗(yàn)顯示，其半致死密度為3.98×107cfu/mL，表明該病原株對(duì)養(yǎng)殖大黃魚具有一定的致病力。

3.3 利用多克隆抗體診斷和防治水產(chǎn)病害

嗜水氣單胞菌不僅能導(dǎo)致多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害發(fā)生，還被國(guó)外列入人體腹瀉病原菌檢測(cè)范圍[21]。多克隆抗體被廣泛應(yīng)用于病原菌診斷檢測(cè)和免疫防治。竇勇等[22]通過(guò)制備兔抗副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的多克隆抗體，為快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的副溶血弧菌奠定基礎(chǔ)。李華等[23]通過(guò)免疫學(xué)方法制備了兔抗鲇愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)的多克隆抗體，對(duì)其特性進(jìn)行分析，并以此為工具建立該病原菌的快速、靈敏的免疫學(xué)檢測(cè)方法。王雪妹[24]通過(guò)制備鰻弧菌(V.anguillarum)特異性多克隆抗體，為免疫保護(hù)性抗原的篩選及其研制疫苗防治鰻弧菌感染打下基礎(chǔ)。Li等[5]也通過(guò)制備副溶血弧菌的鼠源抗血清，結(jié)合免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)鑒定到多個(gè)免疫原性蛋白，其中VP0802對(duì)小鼠的免疫保護(hù)率達(dá)66.7%，可作為潛在候選疫苗。本試驗(yàn)制備了嗜水氣單胞菌的鼠源多克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定其效價(jià)達(dá)40 000，具有良好的結(jié)合病原菌活性，可應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的檢測(cè)和免疫防治。

4 結(jié) 論

自患腸炎病及有體表出血癥狀的大黃魚肝臟組織中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌NDLc-P，經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn)確定其為致病菌，結(jié)合病原菌的生理生化特性及16S rDNA序列分析，綜合判定其為嗜水氣單胞菌，研究還制備了具有良好結(jié)合特性的鼠源多克隆抗體，后續(xù)將應(yīng)用于大黃魚嗜水氣單胞菌病的免疫診斷及防治。