許星龍，夏小婷，陳寧博，黃永震，林鳳鵬,祁興磊，陳 宏，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 河南省泌陽(yáng)縣畜牧局，河南 泌陽(yáng) 463700)

中國(guó)古代以農(nóng)業(yè)立國(guó)，黃牛是一種重要的農(nóng)用家畜。長(zhǎng)期以來(lái)，黃牛作為役用家畜，具有無(wú)可替代的作用，既能提供皮毛、牛肉、牛奶等生活資料，又能耕田耙地，故黃牛是中國(guó)農(nóng)業(yè)社會(huì)生產(chǎn)資料的象征。我國(guó)地方黃牛品種分布廣泛，遺傳資源豐富。目前，我國(guó)有53個(gè)地方黃牛品種[1]。近年來(lái)，對(duì)我國(guó)地方黃牛品種遺傳多樣性的研究日益廣泛，如：Y-SNPs和Y-STRs父系遺傳多態(tài)性研究[2-3]、分子考古研究[4]、全基因組重測(cè)序研究[5]等，使中國(guó)黃牛多元起源的觀點(diǎn)成為共識(shí)，即普通牛(Bostaurus)和瘤牛(Bosindicus)共同影響中國(guó)黃牛的起源馴化，并根據(jù)不同影響程度及地理分布可將中國(guó)地方黃牛分為北方黃牛，中原黃牛和南方黃牛三大類(lèi)。

郟縣紅牛屬于中原黃牛，產(chǎn)于河南省平頂山市郟縣，因毛色多為紅色而得名，使役效果和肉質(zhì)俱佳，屬全國(guó)八大良種黃牛。郟縣紅牛的選育歷史悠久，據(jù)史料記載，在唐宋時(shí)期就已經(jīng)廣泛飼養(yǎng)并有意識(shí)地開(kāi)始選留適合使役的大牛，壯牛?！邦^如罐，眼如蛋，耳如扇”，“老虎脖子石磙腰，木偶蹄子白尾梢”等諺語(yǔ)就是當(dāng)?shù)厝藗冊(cè)陂L(zhǎng)期選種過(guò)程中總結(jié)出來(lái)的[1]。

目前郟縣紅牛遺傳多樣性的研究開(kāi)展較多，Xia等[6]對(duì)郟縣紅牛全基因組進(jìn)行重測(cè)序并對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行詳細(xì)分析，雷初朝等[7]對(duì)包括郟縣紅牛在內(nèi)的我國(guó)八個(gè)地方黃牛品種的mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，但就郟縣紅牛單個(gè)品種而言，mtDNA D-loop區(qū)單倍型類(lèi)型及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)46頭郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)全序列遺傳多樣性進(jìn)行分析，從母系遺傳角度為郟縣紅牛保種選育工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在河南省郟縣紅牛保種場(chǎng)采集35頭郟縣紅牛耳組織樣本，以75%乙醇浸泡保存在-80 ℃冰箱中。本課題組曾對(duì)35頭郟縣紅牛進(jìn)行過(guò)全基因組分析[5-6]，另從GenBank下載11條郟縣紅牛mtDNA D-loop 全序列，其登錄號(hào)為DQ166090-DQ166095，DQ344944，DQ344945，AY119667，AY119668，AY119672，并下載代表普通牛的序列T3(V00654)，代表瘤牛的序列I1(EU177868)，作為普通牛與瘤牛的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 數(shù)據(jù)處理

將本課題組曾對(duì)35頭郟縣紅牛進(jìn)行基因組測(cè)序獲得的全基因組數(shù)據(jù)(SRR11875130-SRR11875159，SRR5507228-SRR5507232)[5-6]，利用生物信息學(xué)方法，借助shell腳本從全基因組的bam文件中提取出35頭郟縣紅牛mtDNA D-loop全序列。利用MEGA7軟件對(duì)46條郟縣紅牛mtDNA D-loop序列與1條普通牛序列及1條瘤牛序列進(jìn)行同源比對(duì)，經(jīng)過(guò)軟件比對(duì)以及人工校正，確定所有mtDNA D-loop序列的長(zhǎng)度及可靠性。將比對(duì)好的序列集合用DNASP5.0軟件統(tǒng)計(jì)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)、單倍型類(lèi)型、單倍型數(shù)量、核苷酸多樣度、Tajima’s D值、平均核苷酸差異等數(shù)據(jù)。采用IQ tree的構(gòu)樹(shù)方法在FigTree v1. 4. 3軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)核苷酸變異與單倍型多樣性

對(duì)46頭郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)全序列進(jìn)行比對(duì)分析，從圖1中發(fā)現(xiàn)38頭郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)全序列的長(zhǎng)度為910 bp，1頭郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)的長(zhǎng)度為909 bp，7頭郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)的長(zhǎng)度為911 bp，表明郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)存在1個(gè)堿基的插入和1個(gè)堿基的缺失。在46頭郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)全序列中共發(fā)現(xiàn)60個(gè)變異位點(diǎn)，占核苷酸總數(shù)的6.59%，其中轉(zhuǎn)換54個(gè)(C/T轉(zhuǎn)換33個(gè)，A/G轉(zhuǎn)換21個(gè))，顛換5個(gè)(A/C顛換3個(gè)，A/T顛換1個(gè)，C/G顛換1個(gè)，A/G/T轉(zhuǎn)換與顛換共存1個(gè))。C+G平均含量為38.5%。

利用DNASP 5.0軟件比對(duì)分析46頭郟縣紅牛mtDNA D-loop序列，共發(fā)現(xiàn)20種單倍型H1-H20，在這20個(gè)單倍型中，平均核苷酸差異(k)為23.04，單倍型多樣度(Hd)為0.853 0，平均核苷酸多樣度(Pi)為0.025 4。根據(jù)Tajima’s D值2.235 0(P<0.05)可知，所有變異在進(jìn)化過(guò)程中均遵循中性進(jìn)化模型。

2.2 郟縣紅牛系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

以普通牛T3與瘤牛I1的mtDNA D-loop序列為對(duì)照，采用IQ tree模型構(gòu)樹(shù)郟縣紅牛的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。IQ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明郟縣紅牛20種mtDNA D-loop單倍型分為普通牛和瘤牛兩大支系，其中普通牛有14個(gè)單倍型(H1、H2、H5、H6、H7、H8、H10、H11、H12、H15、H16、H17、H18與H20)，瘤牛有6個(gè)單倍型(H3、H4、H9、H13、H14與H19)，表明普通牛和瘤牛是郟縣紅牛的兩大母系起源。

圖1 郟縣紅牛20個(gè)mtDNA D-loop單倍型及其多態(tài)位點(diǎn)

圖2 基于郟縣紅牛20個(gè)mtDNA D-loop單倍型構(gòu)建的IQ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

目前已有較多中國(guó)地方黃牛mtDNA D-loop序列遺傳多樣性的研究[7-11]，但基于較大樣本量對(duì)郟縣紅牛mtDNA D-loop序列遺傳多樣性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析46頭郟縣紅牛mtDNA D-loop序列，發(fā)現(xiàn)C+G的平均含量為38.5%，而A+T的平均含量為61.5%，CG含量低于AT含量，這一結(jié)果與中國(guó)黃牛mtDNA D-loop序列的研究結(jié)果基本一致[7-11]，表明這是黃牛mtDNA D-loop區(qū)序列的一個(gè)顯著特征。在郟縣紅牛mtDNA D-loop序列中共檢測(cè)到60個(gè)變異位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換比例很大，有54個(gè)，占90%，轉(zhuǎn)換與顛換比為10.8，遠(yuǎn)高于臨界值2.0，這與先前的研究[11]得到相似的結(jié)果，表明黃牛mtDNA D-loop序列中的堿基替換，以轉(zhuǎn)換為主。46頭郟縣紅牛mtDNA D-loop序列的單倍型多樣度(Hd)為0.8530，平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0254，單倍型多樣度和核苷酸多樣度越大，表明品種遺傳多樣性越豐富，反之則越單一。孫婷等[9]對(duì)26頭南方黃牛品種——吉安牛進(jìn)行mtDNA D-loop序列分析，發(fā)現(xiàn)其單倍型多樣度為0.572 0，平均核苷酸多樣度為0.011 3，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于郟縣紅牛，說(shuō)明郟縣紅牛的mtDNA D-loop遺傳多樣性豐富。IQ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)表明，郟縣紅牛46個(gè)個(gè)體構(gòu)成20個(gè)mtDNA D-loop單倍型，分成普通牛和瘤牛兩大支系。在郟縣紅牛46個(gè)個(gè)體中，普通牛和瘤牛各占23個(gè)個(gè)體，與蔡欣等[11]的研究中6頭郟縣紅牛各有3個(gè)分別屬于普通牛和瘤牛支系的結(jié)果一致。但普通牛支系23個(gè)個(gè)體共享14個(gè)單倍型而瘤牛支系23個(gè)個(gè)體僅有6個(gè)單倍型，普通牛支系有更多的單倍型，表明郟縣紅牛在母系形成過(guò)程中，更多的普通牛祖先類(lèi)型參與郟縣紅牛的品種形成?？傊?，本研

究發(fā)現(xiàn)郟縣紅牛mtDNA遺傳多樣性豐富，是典型的中原黃牛，同時(shí)受到普通牛和瘤牛的影響，具有普通牛和瘤牛兩大母系起源。這些研究結(jié)果對(duì)郟縣紅牛種質(zhì)資源保護(hù)、開(kāi)發(fā)與利用[12]具有重要意義。