黃麗萍,喬博靈,顏雪珍,趙 亭,紀(jì)昌春,楊 崢,張曉霞,郭正萍,羅苓芝

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.西北大學(xué)生命科學(xué)院，陜西 西安 710069)

氣虛是中醫(yī)上的常見(jiàn)證候，多見(jiàn)于先天不足或者后天過(guò)度勞損所致，以少氣懶言、疲勞、面色蒼白、消化功能下降或營(yíng)養(yǎng)不良、消瘦等為證候特點(diǎn)[1]，因常常涉及五臟，導(dǎo)致五臟運(yùn)化失常，使臟腑功能發(fā)生盛衰偏向，繼而可以引發(fā)機(jī)體一系列人體的輕、重疾病，因此氣虛癥狀廣泛存在于許多的中醫(yī)疾病當(dāng)中，需要選用合適的補(bǔ)氣方藥進(jìn)行糾正。比如源于經(jīng)典古方生脈散的中藥保護(hù)品種益氣復(fù)脈注射液，由紅參、麥冬、五味子制備而成[2]，為臨床上常用的一種中藥制劑，具有益氣養(yǎng)陰，復(fù)脈生津的功效[3]；由黃芪和黨參經(jīng)特殊工藝加工而成的制劑參芪扶正注射液[4-5]，具有益氣健脾、培本固元的功效[6]，均被廣泛地應(yīng)用于臨床各種疾病的治療中，并且顯示了良好的改善氣虛癥狀的效果。

雖然臨床中醫(yī)生可以通過(guò)望、聞、問(wèn)、切四診等來(lái)獲知對(duì)氣虛疾病的判斷，然而，臨床上實(shí)際所取得的氣虛癥狀與體征，其性質(zhì)及狀態(tài)均是模糊而不易量化的，并且隨著人群的復(fù)雜化，社會(huì)轉(zhuǎn)型期間眾多因素的影響等等，往往被低估或過(guò)度評(píng)價(jià)，進(jìn)而影響中藥方藥的使用和臨床效果。近年來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病及藥物治療后基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平的研究，成為發(fā)現(xiàn)疾病基因靶點(diǎn)及其功能的重要手段之一[7]。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)臨床常用的具有補(bǔ)氣作用的益氣復(fù)脈注射液和參芪扶正注射液進(jìn)行研究，分別考察氣虛患者經(jīng)過(guò)這兩種中藥制劑治療后的差異表達(dá)基因及其生物學(xué)功能，并進(jìn)行二者之間的韋恩分析，以探尋這兩種制劑發(fā)揮補(bǔ)氣作用的靶基因及其生物學(xué)功能，為后期研究氣虛疾病的分子機(jī)制及其精準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器：NannoDrop 2000c分光光度計(jì)2000(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，基因擴(kuò)增儀(GE4852T，杭州柏恒科技有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX Connect Real-time system，美國(guó)Bio-Rad公司)，離心機(jī)(5424，德國(guó)Eppendorf股份公司)。

1.1.2 藥品與試劑：臨床治療用中藥制劑為益氣復(fù)脈凍干粉針劑(天津天士力之驕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20151205)和參芪扶正注射液(麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：151219)。

另有淋巴細(xì)胞分離劑(Ficoll-Paque,Sigma,中國(guó))，Total RNA Extractor(上海生工生物工程有限公司)，M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，2×SGExcel UltraSYBR Mixture(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氣虛患者的選擇：由臨床中醫(yī)醫(yī)師，依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]，選取2020年8月至2021年6月在陜西省中醫(yī)醫(yī)院收治的以氣虛為主要病證特點(diǎn)的患者20例作為研究對(duì)象，以隨機(jī)數(shù)字表法分為益氣復(fù)脈治療組(YQFM)和參芪扶正注射液治療組(SQFZ)，治療后氣虛癥狀有明顯改善者被納入本項(xiàng)研究。陜西省中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并通過(guò)此研究方案。

1.2.2 分組與給藥：患者入院后分別實(shí)施一個(gè)治療周期(每天1次，共10 d)，治療前后，分別進(jìn)行氣虛的評(píng)分和外周血的采集。氣虛評(píng)分根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，患者外周血采用EDTA抗凝管收集。

1.2.3 抗凝外周血采集和Trizol法提取總RNA：對(duì)采集的抗凝外周血樣品，以淋巴細(xì)胞分離液,應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)，按照TRIzol試劑法提取總RNA；提取完成后的RNA，采用NanoDrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

1.2.4 RNA-Seq樣品及其測(cè)序：RNA-Seq測(cè)序用樣品，為2例患者的2對(duì)(4個(gè))外周血樣品。這2例患者分別經(jīng)益氣復(fù)脈和參芪扶正進(jìn)行治療，并顯示出相似的氣虛級(jí)別及改善程度的。2對(duì)樣品為患者治療前后的外周血樣品，由上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，文庫(kù)質(zhì)量控制和定量使用Agilent2200進(jìn)行，DESeq算法進(jìn)行差異基因篩選。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：以提取的RNA為模板，用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制PCR反應(yīng)體系，包含4 μg RNA和1 μl M-MuLV RT，在PCR儀上進(jìn)行cDNA的合成及擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：25 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min。合成后的cDNA，在Bio-Rad實(shí)時(shí)定量PCR儀上，進(jìn)行SYBR GREEN熒光定量PCR反應(yīng)和檢測(cè)，25 μl反應(yīng)體系，包含80 ng RNA及相應(yīng)的引物，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.4 信息分析

1.4.1 差異表達(dá)基因分析：采用DESeq分析差異表達(dá)基因，差異基因篩選主要參考差異倍數(shù)(Fold change值)及P值作為相關(guān)指標(biāo)，通常選取|Fold change|≥1.5，F(xiàn)DR≤0.05的差異基因作為顯著差異基因。

1.4.2 GO(Gene Ontotology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析：基因篩選出的差異表達(dá)基因，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以校正后的P≤0.05為閾值，滿足此條件的GO詞條和KEGG通路被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 YQFM、SQFZ治療前后的差異表達(dá)基因及其韋恩分析結(jié)果 RNA-Seq實(shí)驗(yàn)共獲得51137個(gè)轉(zhuǎn)錄組mRNA，與治療前相比，治療后顯示有差異的基因，YQFM有873個(gè)(圖1A)，SQFZ有935個(gè)(圖1B)，差異基因分析顯示，差異明顯的基因(|Fold change|≥1.5 FDR≤0.05)，YQFM有60個(gè)，其中34個(gè)基因上調(diào)，26個(gè)基因下調(diào)；SQFZ有85個(gè)，其中40個(gè)基因上調(diào)，45個(gè)基因下調(diào)。

為了取得氣虛相關(guān)基因，即兩個(gè)方藥治療后的共同的差異基因，我們對(duì)兩組差異明顯的基因進(jìn)行了交集，韋恩分析(圖1C)結(jié)果顯示，經(jīng)這兩個(gè)方藥治療后，共有的、差異明顯的基因有6個(gè)，分別是DUSP1、DUSP2、FKBP5、F8A2、C9orf129及EGR1。

A:YQFM治療前后差異基因火山圖；B:SQFZ治療前后差異基因火山圖； C：YQFM和SQFZ差異基因的韋恩分析圖

2.2 YQFM、SQFZ治療前后的差異表達(dá)基因的GO富集分析及其韋恩分析 分別對(duì)兩組差異明顯的基因進(jìn)行GO富集分析，以P≤0.05為閾值，YQFM中滿足此條件的基因，功能富集到生物過(guò)程的GO條目有277條，細(xì)胞組分有15條、分子功能有48條；SQFZ滿足此條件的基因中，功能富集到生物過(guò)程的GO條目有236條，細(xì)胞組分有22條、分子功能有67條。

進(jìn)行交集分析后，兩組共有的生物過(guò)程的GO條目有32條(圖2A)，包括晝夜節(jié)律(Circadian rhythm)、一氧化氮合成(Positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)等；細(xì)胞組分有2條(圖2B),包括質(zhì)膜組成成分(Integral component of plasma membrane)和質(zhì)膜外側(cè)成分(External side of plasma membrane)；分子功能有6條(圖2C)，包括熱休克蛋白結(jié)合(Heart shork protein binding),蛋白激酶磷酸化(MAP kinase tyrosine/serine/thereonine phosphatase activity)等。

圖2 YQFM和SQFZ治療前后差異基因的GO富集分析及其韋恩分析(P≤0.05)

2.3 YQFM、SQFZ治療前后的差異表達(dá)基因的KEGG富集分析及其韋恩分析 對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，YQFM中共富集到96條生物通路，SQFZ中共富集到195條生物通路，它們共有的生物通路有10條，大體可以分為3類(lèi)，第一類(lèi)與環(huán)境信息相關(guān)，主要為信號(hào)傳導(dǎo)，包括MAPK(Mitogen-activated protein kinases)信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路；第二類(lèi)與內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)相關(guān)，包括脂肪細(xì)胞因子通路(Adipocytokine signaling pathway)和雌激素信號(hào)通路和NOD樣受體(NOD-like receptor signaling pathway)；第三類(lèi)是對(duì)外來(lái)物的應(yīng)答反應(yīng)，包括瘧疾(Malaria)、非洲錐蟲(chóng)病(African trypanosomiasis)、軍團(tuán)桿菌病(Legionellosis)、弓形體病(Toxoplasmosis) 和沙門(mén)菌(Salmonella)(圖3)。

圖3 YQFM和SQFZ差異基因KEGG富集的

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)隊(duì)列樣本中共有差異基因的表達(dá)變化 我們對(duì)20例有氣虛癥狀的患者，進(jìn)行了YQFM和SQFZ的治療，經(jīng)臨床醫(yī)師評(píng)估有明顯改善的患者，進(jìn)行了治療前和治療后外周血的采集和PBMCS的分離，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR，我們分別對(duì)20例樣品中5個(gè)共有差異基因(F8A2、DUSP1、DUSP2、EGR1和FKBP5)的mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖4)，與治療前相比，基因水平總體下調(diào)，尤其FKBP5水平的下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001),可能與氣虛疾病密切相關(guān)。

A：DUSP1表達(dá)水平；B：DUSP2表達(dá)水平；C：FKBP5表達(dá)水平；D：EGR1表達(dá)水平；E：F8A2表達(dá)水平

3 討 論

眾所周知，中藥復(fù)方具有多成分、多功效的特點(diǎn)，因此，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所呈現(xiàn)的差異基因與復(fù)方的所有功效相關(guān)，無(wú)法確定某一特定功效的靶基因。比如，臨床中常用的補(bǔ)氣類(lèi)藥物，療效顯著的有益氣復(fù)脈及參芪扶正，補(bǔ)氣作用只是它們發(fā)揮多種功效中的一種，其中益氣復(fù)脈為氣陰并補(bǔ)制劑，既能補(bǔ)氣，又能養(yǎng)陰，常用于心力衰竭及心臟受損等疾病的治療[9-10]，參芪扶正為補(bǔ)氣健脾制劑，既能補(bǔ)氣，又能健脾[11-12]，通過(guò)對(duì)治療前后的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，可分別獲知與其所有功能相關(guān)的基因，即益氣復(fù)脈注射液治療后所獲得的差異基因，與補(bǔ)氣和養(yǎng)陰功能相關(guān)；參芪扶正注射液治療后所獲得的差異基因，則與補(bǔ)氣和健脾相關(guān)，如果只分析其中一個(gè)，無(wú)法確定哪些基因?yàn)榕c補(bǔ)氣相關(guān)的基因?？紤]到補(bǔ)氣是兩個(gè)制劑共同的中醫(yī)功效，本研究對(duì)它們的差異基因進(jìn)行韋恩分析，從益氣復(fù)脈的60個(gè)基因和參芪扶正的85個(gè)差異基因中，獲取了6個(gè)共同的差異基因，可判定為與補(bǔ)氣相關(guān)的候選基因，進(jìn)一步的一組臨床樣品分析，證實(shí)FKBP5水平的下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明FKBP5是這兩個(gè)制劑發(fā)揮補(bǔ)氣作用的潛在靶基因。

FKBP5(FK506 binding protein 51) 是親免素蛋白家族成員之一，可與其他蛋白如Hsp90、Hsp70、p23等一起與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)形成復(fù)合物[13]，是GR復(fù)合物功能的重要調(diào)節(jié)者[14]。FKBP5可以促使GR復(fù)合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生存、藥物應(yīng)答等多種功效[15]。此外，F(xiàn)KBP5基因多態(tài)性與抑郁發(fā)病率密切相關(guān)[16]。研究顯示，F(xiàn)KBP5高表達(dá)水平可以促進(jìn)抑郁的發(fā)生，而抗抑郁藥可以下調(diào)FKBP5的水平[17]。雖然抑郁并不屬于中醫(yī)范疇的病名，但其臨床表現(xiàn)有氣虛的癥狀，這提示補(bǔ)氣方藥可以通過(guò)下調(diào)FKBP5水平改善抑郁病人的癥狀。

另外，GO和KEGG富集的交際分析顯示，它們生物功能大都與MAPK信號(hào)通路相關(guān)。MAPK是一類(lèi)絲氨酸或者蘇氨酸的蛋白激酶，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)時(shí)有著十分重要而廣泛的作用，不僅有著“能量開(kāi)關(guān)”的美名，具有調(diào)控ATP產(chǎn)生的功效[18],而且可以介導(dǎo)信號(hào)通路下游的許多生物過(guò)程包括炎癥過(guò)程,能量代謝,免疫應(yīng)答等，這些生物過(guò)程被認(rèn)為是許多常見(jiàn)慢性病的重要因素[19-22]，說(shuō)明補(bǔ)氣不僅能改善氣虛癥狀，而且有助于這些慢性病的治療，提示補(bǔ)氣在多種疾病治療中的重要作用。

綜上所述，MAPK信號(hào)通路是益氣復(fù)脈和參芪扶正發(fā)揮補(bǔ)氣作用的核心通路。FKBP5基因水平下調(diào)是它們發(fā)揮補(bǔ)氣作用的分子標(biāo)志。