趙 琳，鞏 楠，常會(huì)敏

鼻咽癌是最常見的耳鼻咽喉部惡性腫瘤，由于其發(fā)病早期難以發(fā)現(xiàn)及原發(fā)部位隱蔽等特點(diǎn)，確診時(shí)大多已屬中晚期，并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故病死率較高[1]。放化療相結(jié)合的方法是目前臨床主要治療手段，但放射反應(yīng)和化療藥物的不良反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致不少后遺癥的發(fā)生，治療后也常出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的情況[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥輔助治療因其能增加鼻咽癌對(duì)放化療的敏感性及減少不良反應(yīng)發(fā)生的特點(diǎn)，目前成為抗鼻咽癌研究的熱點(diǎn)之一[3-4]。此外，天然植物抗腫瘤藥物因其低毒性、高生物利用度等特點(diǎn)已受到了醫(yī)藥學(xué)界的廣泛關(guān)注[5]。葛根素主要是從臨床常用的中藥葛根當(dāng)中經(jīng)過一系列特殊的處理而提取出來的一種異黃酮類化合物。研究表明，葛根素具有抗炎、降壓、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗腫瘤等功效，且具有低毒性及高效性[6-7]。目前關(guān)于葛根素用于鼻咽癌的研究甚少，本研究以人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞作為觀察對(duì)象，探討葛根素對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并分析可能的相關(guān)分子機(jī)制，為葛根素在鼻咽癌中的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞系購(gòu)置于上海盈公生物技術(shù)有限公司，葛根素、10%胎牛血清、胰蛋白酶及RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)置于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒及Annexin V-PE/ 7-AAD凋亡流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于美國(guó)BD公司，細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)試試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將CNE-1細(xì)胞復(fù)蘇，離心收集，用含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，接種至培養(yǎng)皿中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，均勻接種至6孔板中，使其濃度為每孔5×105個(gè)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。然后分為對(duì)照組、低、中及高濃度組，加入不同濃度葛根素（0，25、50、100 μM），培養(yǎng)48 h。

1.3 檢測(cè)方法 ①CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖：將濃度為5×104個(gè)/ml的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，空白對(duì)照孔指的是僅加入培養(yǎng)基而不接種細(xì)胞。在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8溶液，培養(yǎng)48 h，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白組。周圍孔加入100 μl PBS，培養(yǎng)箱中孵育過夜。繼續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞48 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃條件孵育2 h，搖床振蕩10 min，450 nm處測(cè)定吸光度值OD。細(xì)胞增殖率（%）=[OD（實(shí)驗(yàn)組）-OD（空白組）]/[OD（對(duì)照組）-OD（空白組）]×100%；②流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞處理如前，按照Annexin V-PE/ 7-AAD試劑盒的說明進(jìn)行嚴(yán)格操作，在室溫中避光反應(yīng)10 min，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（即正常細(xì)胞不加Annexin和PI），流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。③DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞ROS水平：細(xì)胞處理如前，去PBS加入稀釋好的DCFH 1 ml，在37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，每隔3 min混勻一次；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。④MDA含量檢測(cè)：取不同處理組細(xì)胞，按照MDA測(cè)試試劑盒說明進(jìn)行嚴(yán)格操作，取上清于532 nm處測(cè)定吸光度值OD，計(jì)算細(xì)胞MDA含量。⑤T-SOD活性檢測(cè)：取不同處理組細(xì)胞，按照T-SOD測(cè)試盒進(jìn)行操作，于550 nm處的測(cè)定吸光度值OD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SSPS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)和方差分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖的影響 在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，各濃度葛根素處理組CNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。進(jìn)一步MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，葛根素處理細(xì)胞48 h后，各濃度組的CNE-1細(xì)胞增殖活力降低，且隨著葛根素濃度的升高而降低；各組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖的影響（Bar=100μM）

2.2 葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡的影響 各濃度葛根素組與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率均明顯上升，且凋亡率隨著葛根素濃度的升高而增加。各組之間互相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡的影響（n=3）

2.3 葛根素對(duì)細(xì)胞ROS水平的影響 葛根素處理細(xì)胞48 h后，各濃度組的CNE-1細(xì)胞中ROS水平較對(duì)照組均有所增加，且隨著葛根素濃度的升高而增加；組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞ROS水平的影響（n=3）

2.4 葛根素對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞MDA含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素處理細(xì)胞48 h后，各濃度組CNE-1細(xì)胞MDA含量較對(duì)照組有所增加，且隨著葛根素濃度的升高而增加。組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞MDA含量的影響（n=3）

2.5 葛根素對(duì)細(xì)胞T-SOD活性的影響 與對(duì)照組比較，葛根素處理細(xì)胞48 h后，各濃度組的CNE-1細(xì)胞中T-SOD活性減小，且隨著葛根素濃度的升高而降低；組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞T-SOD活性的影響（n=3）

3 討論

作為頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，鼻咽癌的分布具有明顯的地域性，全世界80%的患者都在華南地區(qū)[8]。鼻咽癌起源于鼻咽上皮細(xì)胞，其早期缺乏特異性、侵襲性強(qiáng)及易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等為其特點(diǎn)，因此嚴(yán)重威脅人類健康[9]。雖然鼻咽癌對(duì)放化療普遍敏感，但部分患者也難以避免發(fā)生疾病進(jìn)展，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致最終預(yù)后較差[10]。鼻咽癌發(fā)生發(fā)展可能是環(huán)境、病毒、基因等多種因素共同參與、互相作用的結(jié)果。但目前鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制有待闡明，且缺乏十分有效的靶向治療手段。尋找輔助藥物以減輕鼻咽癌放化療的不良反應(yīng)和耐藥性已經(jīng)成為近年來腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[11]。

豆科葛屬植物野葛干燥根即為葛根，是一種臨床上廣泛用于升陽止瀉、解饑退熱、透疹以及生津等方面的中藥。葛根素主要是從干燥野葛根中提取所得。具有降壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等藥理作用[7]。細(xì)胞凋亡是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，很多抗癌藥物的作用機(jī)制均與其誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡密切相關(guān)。本研究通過觀察了葛根素對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1增殖、凋亡的影響，結(jié)果提示不同濃度葛根素可有效抑制CNE-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且其效應(yīng)呈濃度依賴性。本研究結(jié)果與在乳腺癌，膽管癌，宮頸癌，胰腺癌等中的研究結(jié)果一致，提示葛根素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制效應(yīng)，并能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-15]。

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞在內(nèi)外環(huán)境的刺激下產(chǎn)生過量活性氮類物質(zhì)（reactive nitrogen species，RNS）及活性氧類物質(zhì)等活性物質(zhì)的過程[16-17]。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的活性物質(zhì)超出機(jī)體的清除能力時(shí)，則導(dǎo)致氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào)，會(huì)對(duì)正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成不可逆的損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致體細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)化，激活致癌通路促進(jìn)細(xì)胞癌變[18]。正常細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)增強(qiáng)能夠破壞自身的氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)腫瘤等多種疾病的發(fā)生，而腫瘤細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的耐受可以直接或間接影響腫瘤細(xì)胞耐藥性。因此，靶向氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白調(diào)控細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平已經(jīng)成為防治腫瘤的新策略[19]。大量研究證實(shí)，氧化應(yīng)激異常可通過Fas通路、P53/MPTP通路、NF-kB通路及JNK 通路等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。MDA及SOD是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組CNE-1細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量以及T-SOD活性，以觀察葛根素對(duì)腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素能明顯上調(diào)細(xì)胞ROS、MDA水平，降低T-SOD活性，提示在本實(shí)驗(yàn)條件下葛根素對(duì)CNE-1細(xì)胞發(fā)揮了促氧化作用，而這種促氧化作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能有關(guān)。眾多研究證實(shí)，葛根素是一種天然的抗氧化活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞通常發(fā)揮抗氧化作用[21-22]。但隨著研究的深入，也有研究發(fā)現(xiàn)包括葛根素在內(nèi)的部分黃酮類化合物，在特定條件下如高濃度、長(zhǎng)時(shí)間作用也表現(xiàn)出促氧化作用，引起機(jī)體ROS水平升高，抗氧化酶活性下降等，從而導(dǎo)致生物分子損傷，特別是DNA和蛋白分子[23-24]。

綜上所述，本研究提示葛根素能夠抑制CNE-1細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗鼻咽癌的作用，其作用機(jī)制可能與葛根素促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)?，F(xiàn)階段，葛根素在臨床上得到廣泛應(yīng)用，葛根素及其衍生物、生物制劑等都取得了顯著的抗腫瘤效果，但藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑復(fù)雜多樣，本研究為更進(jìn)一步探討葛根素在治療鼻咽癌等惡性腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值提供了重要參考。