李丹,王文千,李明亮,方小明,彭文君,田文禮*,魏穎*

1(中國農(nóng)業(yè)科學院 蜜蜂研究所,北京 100093) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京 100015)

蜂王漿是從工蜂(Apismellifera)的下頜和下咽腺分泌的一種乳脂狀物質(zhì)。它是所有蜜蜂幼蟲在生命前3 d的食物；然后,工蜂們轉(zhuǎn)向食用主要由蜂蜜和花粉組成的蜂糧,而蜂王終身食用蜂王漿[1-3]。蜂王漿已被應用于醫(yī)療產(chǎn)品、健康營養(yǎng)品、化妝品和商業(yè)用途。從蜂王漿中分離出的各種生物活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、肽、脂肪酸和酚類化合物,都可用于藥物研究和產(chǎn)品開發(fā)。蜂王漿具有抗微生物、抗氧化劑、促進傷口愈合、抗衰老、抗癌、抗炎、抗高血壓、抗高血脂,還具有雌激素、神經(jīng)營養(yǎng)作用、免疫調(diào)節(jié)功能特性[4]。但是,目前國內(nèi)外關于蜂王漿對免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究較少。本實驗通過分析蜂王漿對環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的體重、臟器指數(shù)及形態(tài)、細胞因子、白細胞計數(shù)、免疫球蛋白含量、T/B淋巴細胞增殖能力、睪酮等指標的影響,探究其免疫調(diào)節(jié)作用。著力為開發(fā)蜂產(chǎn)品的保健應用提供新思路,為拓寬特色蜂產(chǎn)品的商業(yè)用途提供理論依據(jù)的同時促進農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展,符合國家當前產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整及提高農(nóng)民收入的政策,有利于蜂產(chǎn)品市場的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

48只6～8 周齡健康 SPF 級雄性KM小鼠(37～46 g),北京維通利華實驗動物技術有限公司,進行適應性喂養(yǎng) 3 d后用于實驗,實驗動物飼養(yǎng)于無菌環(huán)境,溫度控制在20～22 ℃；酪蛋白、0.4%臺盼藍染色液和0.33%中性紅染色液,北京索萊寶生物技術有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI—1640 培養(yǎng)基,Hyclon 公司；胰酶、青霉素/鏈霉素、紅細胞裂解液和CCK-8,碧云天生物技術研究所；脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)、刀豆蛋白、(Con-A)、[3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽, MTT],Sigma Aldrich 公司；IgG ELISA Kit、IgM ELISA Kit、IL-2 ELISA Kit、IL-4 ELISA Kit,北京百智生物科技有限公司；小鼠睪酮ELISA試劑盒,南京森倍伽生物科技。

BD C6 流式細胞儀,美國 Thermofisher 公司；CKX-4 倒置相差顯微鏡,日本奧里巴斯有限公司；Spectra MR 多功能酶標儀,美國 Dynex 公司；血液分析儀,濟南漢方醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及受試樣品給予

48只昆明小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后,稱其體重作為初始體重,隨機分為空白組、酪蛋白組0.25 g/(kg·bw)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)模型組、蜂王漿低劑量組1.25 g/(kg·bw)、蜂王漿中劑量組2.5 g/(kg·bw)、蜂王漿高劑量組5.0 g/(kg·bw),共計6組,每組8只[5]。所有小鼠每日定時灌胃,蜂王漿組給予1.25、2.5、5 g/(kg·bw)蜂王漿灌胃,空白組和環(huán)磷酰胺組每日灌胃相同體積的生理鹽水,酪蛋白組則依照0.25 g/(kg·bw)劑量的酪蛋白進行灌胃,連續(xù)灌胃30 d[6]。在灌胃第27天時,除空白組外,其余各組則通過連續(xù)3 d腹腔注射80 mg/(kg·bw)的環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫低下小鼠模型,空白組注射相同體積的生理鹽水。連續(xù)灌胃30 d后斷食不斷水,次日檢測各項指標[7]。

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 體重變化

適應性喂養(yǎng)3 d后,隨機進行分組并記錄初始體重,并且在處死前再次稱量體重,記為終末體重[8]。

1.2.2.2 免疫臟器指數(shù)

對每組動物進行摘眼球取血后斷頸處死,取胸腺和脾臟,稱重,臟器質(zhì)量(mg)/終末體重(g)即得脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)[8]。

1.2.2.3 脾臟和肝臟形態(tài)學觀察

用甲醛固定液將分離到的脾臟和肝臟進行固定、包埋、切片、染色,鏡檢,采集圖像,對脾臟和肝臟組織進行形態(tài)學分析。

1.2.2.4 外周血白細胞計數(shù)

對每組動物進行摘眼球取血時,取適量全血于 EDTA 抗凝管中,充分混勻,用血液分析儀對白細胞進行計數(shù)[7]。

1.2.2.5 外周血免疫球蛋白含量測定

取血于2 mL離心管中,4 ℃靜置過夜,低溫冷凍離心10 min,轉(zhuǎn)速3 000 r/min,制得血清,取50 μL 血清,使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清中 IgG 和 IgM 的含量。

1.2.2.6 血清中細胞因子水平測定

另取200 μL血清,使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清中IL-4、IL-6的含量[9]。

1.2.2.7 小鼠脾淋巴細胞增殖能力的檢測

參考文獻[10]的方法制備脾細胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整脾細胞濃度至 5×106個/mL，輕輕吹打使細胞懸液均質(zhì)，吸取90 μL上述濃度均質(zhì)后的脾細胞懸液至96孔培養(yǎng)板中，每個樣本做6個重復，再以相同順序向樣品孔中分別添加10 μL ConA/LPS(3個ConA孔，3個LPS孔)，所有樣品孔加完之后將培養(yǎng)板放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出96孔板，每孔添加10 μL CCK-8，繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀檢測490 nm處的OD值，空白組為灌胃生理鹽水小鼠淋巴細胞，淋巴細胞的增殖能力通過刺激指數(shù)(stimulation index，SI)評估[10]：

(1)

1.2.2.8 睪酮含量測定

另取50 μL血清,使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清中睪酮的含量[11]。

1.3 實驗方法

2 結(jié)果與討論

2.1 體重變化

從表1來看,6個組間小鼠的初末體重均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),灌胃期結(jié)束后,5個造模組小鼠體重與空白組相比體重增長量均降低,但差異不顯著(P>0.05)。與模型組相比,蜂王漿各個劑量組體重增加量均不顯著(P>0.05)。

表1 蜂王漿對免疫抑制小鼠體重的影響 單位：g

2.2 免疫臟器指數(shù)

如圖1、2所示,對比空白組,模型組2項臟器指數(shù)顯著下降(P<0.05),相比模型組,酪蛋白陽性對照組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)出現(xiàn)了上升趨勢,蜂王漿各劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)也存在升高的趨勢,但差異并不顯著(P>0.05)。

圖1 小鼠胸腺指數(shù)Fig.1 Mice thymus index 注：* P<0.05,與空白組比(下同)

圖2 小鼠脾臟指數(shù)Fig.2 Mice spleen index

2.3 脾臟和肝臟形態(tài)學觀察

脾臟 HE 染色切片如圖3所示,空白組小鼠的脾臟組織形態(tài)規(guī)則完整,白髓、紅髓正常,邊界明晰,脾小結(jié)發(fā)育正常。環(huán)磷酰胺模型組脾臟組織中白髓和紅髓界限不明確,脾小結(jié)存在嚴重破損現(xiàn)象,脾臟存在腫大現(xiàn)象。與環(huán)磷酰胺模型組相比,酪蛋白陽性對照組脾臟結(jié)構(gòu)并無明顯改觀,蜂王漿中、高劑量組脾小結(jié)發(fā)育狀況均有改善,結(jié)構(gòu)完整清晰,蜂王漿中劑量組的結(jié)構(gòu)形態(tài)得到很大程度的改善。

a-空白組；b-酪蛋白組；c-模型組；d-王漿低劑量組； e-王漿中劑量組；f-王漿高劑量組圖3 蜂王漿對免疫低下小鼠脾臟組織形態(tài)學 變化的影響(×5)Fig.3 Effect of royal jelly on morphological changes in spleen tissue of immunocompromised mice

肝臟 HE 染色切片如圖4所示,由小鼠的肝切片可見,空白組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整,匯管區(qū)無炎性細胞浸潤,肝細胞狀態(tài)正常。環(huán)磷酰胺模型組和酪蛋白陽性對照組中,肝細胞壞死情況較嚴重,肝索排列混亂無規(guī)則,存在炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。蜂王漿中、高劑量組較環(huán)磷酰胺模型組肝組織結(jié)構(gòu)得到很大程度的改善。

a-空白組；b-酪蛋白組；c-模型組；d-王漿低劑量組； e-王漿中劑量組；f-王漿高劑量組圖4 蜂王漿對免疫低下小鼠肝臟組織形態(tài)學 變化的影響(×10)Fig.4 Effect of royal jelly on morphological changes in liver tissue of immunocompromised mice

2.4 外周血白細胞計數(shù)

如圖5所示,與空白組相比,環(huán)磷酰胺模型組小鼠全血白細胞計數(shù)呈現(xiàn)顯著減少趨勢(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺模型組相比,酪蛋白陽性對照組白細胞含量基本無差異；蜂王漿灌胃后,各劑量組白細胞數(shù)量逐漸恢復至較高水平；與環(huán)磷酰胺模型組相比,蜂王漿中劑量組白細胞計數(shù)呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P<0.05),且基本上恢復至空白組白細胞含量水平。

圖5 小鼠外周血白細胞計數(shù)Fig.5 White blood cell count of mice 注:#P<0.05,與模型組比(下同)

2.5 血清免疫球蛋白含量測定

如圖6、7所示,與空白組相比,環(huán)磷酰胺模型組血清 IgG 和 IgM 質(zhì)量濃度均呈顯著下降趨勢(P<0.05),酪蛋白陽性對照組血清 IgG 和 IgM 質(zhì)量濃度較環(huán)磷酰胺模型組均有提高；蜂王漿中、高劑量組血清中的 IgG 和IgM水平較模型組有顯著提高(P<0.05)。且蜂王漿中、高劑量組的血清IgG、IgM水平均已超過空白組。

2.6 血清中細胞因子水平測定

如圖8所示,小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后,小鼠血清中IL-4水平組間無顯著性差異。如圖9所示,與空白組相比,環(huán)磷酰胺模型組血清IL-6水平顯著降低(P<0.05),說明免疫低下模型構(gòu)建成功。與環(huán)磷酰胺模型組比較,酪蛋白陽性對照組血清IL-6水平呈上升趨勢；經(jīng)蜂王漿干預后,中、高劑量組IL-6顯著升高(P<0.05),高劑量組對血清IL-6水平升高效果優(yōu)于中劑量組。

圖6 小鼠血清IgG水平Fig.6 Mice serum IgG level

圖7 小鼠血清IgM水平Fig.7 Mice serum IgM level

圖8 小鼠血清IL-4水平Fig.8 Mice serum IL-4 level

圖9 小鼠血清IL-6水平Fig.9 Mice serum IL-6 level

2.7 小鼠脾淋巴細胞增殖能力的檢測

如圖10所示,對比空白組,環(huán)磷酰胺模型組T淋巴細胞的增殖能力被明顯抑制(P<0.05),這說明小鼠的特異性免疫功能受到影響,進一步說明造模成功。相較于環(huán)磷酰胺模型組,酪蛋白陽性對照組T淋巴細胞增殖能力有提高,但效果不顯著；與環(huán)磷酰胺模型組相比,蜂王漿(中、高)劑量處理后的小鼠,其T淋巴細胞增殖能力顯著增強(P<0.05)。

如圖11所示,在本實驗中,環(huán)磷酰胺模型組B淋巴細胞増殖顯著低于空白組(P<0.05),說明通過注射環(huán)磷酰胺,小鼠的體液免疫功能受到嚴重損傷。酪蛋白陽性對照組與環(huán)磷酰胺模型組B淋巴細胞増殖能力差異不大；蜂王漿中、高劑量組B淋巴細胞增殖能力高于環(huán)磷酰胺模型組,其中中劑量組B淋巴細胞增殖能力具有顯著提升(P<0.05)。綜上可知,蜂王漿對于免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖能力的促進作用較明顯。

圖10 T淋巴細胞增殖能力Fig.10 T lymphocyte proliferation ability

圖11 B淋巴細胞增殖能力Fig.11 B lymphocyte proliferation ability

2.8 睪酮含量測定

如圖12所示,蜂王漿各個劑量組睪酮含量均低于空白組,但差異不顯著；與環(huán)磷酰胺模型組相比,各劑量組血清睪酮水平無顯著變化,提示通過膳食補充蜂王漿并不會對小鼠血清睪酮水平變化產(chǎn)生影響。

圖12 血清中睪酮含量變化Fig.12 Changes in serum testosterone levels

3 結(jié)論與討論

蜂王漿是營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性化合物的豐富來源,在生物活性和藥物應用中具有廣泛的應用潛力。蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、酚類和類黃酮是影響蜂王漿各種藥物特性的主要生物活性化合物[12]。

免疫調(diào)節(jié)反應具有激活抗體形成或抑制白細胞活性的功能,其在變態(tài)反應、癌癥和炎癥中起重要作用[13]。一項針對兒童的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的科學研究首次表明,蜂王漿給藥3個月后,其癥狀顯著改善[14]。蜂王漿的抗過敏因子可以抑制白細胞介素4(IL-4)的產(chǎn)生,IL-4是由CD3激活ovalbumin(OVA)/alum-immunized脾細胞誘導產(chǎn)生的。MRJP-3(70 kDa)糖蛋白抑制T細胞產(chǎn)生IL-4、IL-2和IFN-γ,從而抑制細胞增殖。腹腔注射MRJP-3發(fā)現(xiàn)在OVA/血清誘導的變態(tài)反應小鼠中抗OVA IgG1和IgE的血清免疫水平受到抑制,而可溶性MRJP-3經(jīng)熱處理后降低了抗原性,并維持了其對卵清蛋白抗體應答的抑制作用。體內(nèi)和體外研究均表明MJRP-3具有很強的免疫調(diào)節(jié)活性[15]。此外,較低濃度的蜂王漿和3,10-HDA的水提取物通過觸發(fā)刀豆蛋白A(Con-A)激活T細胞增殖并增強IL-2的產(chǎn)生,而較高濃度的蜂王漿水提取物、干燥蜂王漿粉末和trans-10-HDA通過降低IL-2和NO產(chǎn)生來抑制T細胞增殖。蜂王漿的水提取物具有復雜的生物活性和較強的免疫調(diào)節(jié)活性[16]。

眾所周知,環(huán)磷酰胺是一種使用廣泛的細胞毒性藥物,普遍應用于腫瘤的治療中,可對骨髓的功能產(chǎn)生抑制作用,使白細胞數(shù)量降低。環(huán)磷酰胺的代謝產(chǎn)物對細胞產(chǎn)生了很強的毒性作用,這一系列代謝產(chǎn)物通過交聯(lián)作用使DNA和蛋白質(zhì)烷基化。環(huán)磷酰胺可以通過抑制免疫器官的功能并造成體重下降,并且使得各種血細胞比例失衡,從而產(chǎn)生免疫功能的抑制[17]。

本實驗先進行蜂王漿干預30 d,實驗結(jié)束前3 d注射環(huán)磷酰胺,評價蜂王漿對免疫功能的調(diào)節(jié)作用。未注射環(huán)磷酰胺的小鼠作為空白組,考慮到蜂王漿干物質(zhì)中含量最高的是蛋白質(zhì),故給予陽性對照組與蜂王漿中劑量組中蛋白相同劑量的酪蛋白以消除影響。

根據(jù)實驗得出,各組小鼠體重增量均無顯著差異,但造模后小鼠體重增量下降,免疫低下小鼠模型構(gòu)建成功,這也說明選定劑量的環(huán)磷酰胺對小鼠具有較強的毒性[18]。

機體的免疫水平一定程度上受脾臟和胸腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能狀態(tài)的影響[18]。本實驗中,環(huán)磷酰胺模型組小鼠的脾臟指數(shù)較空白組顯著降低,病理檢查提示存在脾臟損傷的情況；在蜂王漿不同劑量的干預下,脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均出現(xiàn)了不同程度的改善。同時肝臟內(nèi)免疫細胞含量較高,肝臟通過肝門靜脈與脾臟相連,兩者關系非常密切,脾損傷必然會導致肝損傷。與空白組相比,模型組小鼠的脾臟和肝臟HE切片觀察可見發(fā)育狀況差,形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則,而經(jīng)蜂王漿干預后,小鼠的脾臟和肝臟組織結(jié)構(gòu)逐漸改善。提示蜂王漿可在一定程度上對胸腺、脾臟、肝臟的發(fā)育具有促進作用以及還原修復的作用。

白細胞特有的吞噬功能使其在對抗病原體方面起著關鍵作用,因此,白細胞水平的下降會對免疫應答水平造成威脅,增加機體患病的概率[19]。從這個角度上講,白細胞的含量在一定程度上也是機體免疫應答情況的反應。本實驗觀察到環(huán)磷酰胺造模后,小鼠外周血白細胞計數(shù)相比空白組均顯著降低,在蜂王漿干預后出現(xiàn)改善。提示蜂王漿可以改善免疫低下小鼠的免疫功能。

IgG 在抗感染、免疫監(jiān)視、吞噬并溶解靶細胞過程中發(fā)揮著重要作用,影響體液免疫水平；IgM 在初次免疫中占據(jù)重要地位,對于機體免疫防御意義重大,具有很強的抗感染作用。本研究中,模型組小鼠血清 IgG 和 IgM 含量有降低趨勢,并在部分蜂王漿干預組中得到恢復。提示蜂王漿可能通過恢復 IgG 和 IgM 含量來增強機體的體液免疫。

細胞因子是由蛋白質(zhì)或肽類組成,通過與相應受體結(jié)合來介導免疫應答反應[20]。環(huán)磷酰胺主要通過影響 Toll 樣受體信號通路,活化 NF-κB通路,從而對機體產(chǎn)生毒性作用[21-22]。本實驗中,相比空白組,模型組細胞因子IL-6濃度明顯下降,經(jīng)蜂王漿干預后,IL-6含量均升高并向空白組回歸。提示蜂王漿可能通過影響細胞因子的分泌或影響相關通路而達到改善機體的免疫功能的作用。

T/B 淋巴細胞對于機體的細胞免疫和體液免疫至關重要,ConA和LPS分別誘導活化T/B 淋巴細胞,T/B 淋巴細胞的增殖活性影響著免疫應答水平的高低[23-24]。本實驗中,模型組T/B淋巴細胞增值率比空白組明顯降低,與模型組相比,給予蜂王漿處理能不同程度提升T/B淋巴細胞的增殖率,從而提升免疫水平。

觀察到蜂王漿中劑量組小鼠外周血白細胞計數(shù)、T/B 淋巴細胞的增殖能力均高于蜂王漿低劑量、高劑量組,注意到相關研究中,蜂王漿對小鼠的巨噬細胞吞噬功能的作用也有類似的效應[25],其劑量分組與本實驗相近,且其中3.06 g/kg的中劑量組的巨噬細胞吞噬指數(shù)高于1.53 g/kg的低劑量組和6.12 g/kg的高劑量組,這說明蜂王漿對免疫功能的恢復能力可能具有最佳劑量范圍,劑量過低可能沒有達到恢復免疫功能閾值的劑量,劑量過高則可能增加代謝負擔。

通過注射環(huán)磷酰胺不僅可以產(chǎn)生免疫抑制,還可以引發(fā)生殖毒性,因此本實驗對生殖功能相關指標進行了簡單的檢測。睪酮對于男性精子的生成和第二性征的形成起關鍵作用,血清中睪酮水平長期處于低位可對機體造成多種負面影響,如出現(xiàn)體重增加、肌肉質(zhì)量降低、疲勞感加重、勃起功能障礙和性欲低下等癥狀[26]。本實驗中,各個處理組之間睪酮水平均無統(tǒng)計學差異,提示蜂王漿可能對雄性小鼠體內(nèi)睪酮水平恢復無顯著影響。

本實驗初步探究了蜂王漿對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的體重、免疫臟器指數(shù)、脾臟與肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、外周血白細胞數(shù)量、血清免疫球蛋白、細胞因子、脾淋巴細胞增殖能力、睪酮的影響,結(jié)果提示蜂王漿對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的多項免疫功能均有較顯著的改善作用,為蜂王漿的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。