張光艷,何宏,周曉紅,王玲麗,劉同杰,易華西,公丕民*,張?zhí)m威*

1(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266000) 2(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島,266003) 3(青島市中心醫(yī)院,山東 青島,266042)

牛乳引起嬰幼兒和兒童過敏發(fā)生率約1%～7.5%,而酪蛋白作為牛乳蛋白最主要的過敏原之一,與特異性IgG介導(dǎo)的兒童牛乳過敏甚至持續(xù)性過敏密切相關(guān)[1]。由酪蛋白造成的持續(xù)性過敏反應(yīng)不容忽視,能夠?qū)е屡c胃腸道和特異性皮炎相關(guān)的過敏反應(yīng)[2-3]。近年來,用于避免嬰幼兒過敏的配方奶粉數(shù)量一直在增加,這些低過敏原性配方包括水解蛋白配方和合成氨基酸配方[4]。酪蛋白作為嬰幼兒配方奶粉的主要蛋白原料,在含有接近25種蛋白質(zhì)組分的牛乳中,具有和乳清蛋白同等的致敏潛力[5]。然而,牛乳蛋白的抗原結(jié)合表位可能因不同蛋白來源或加工方法而有差異,配方奶粉中的蛋白質(zhì)來源或加工方法也可能會(huì)對其抗原反應(yīng)性有影響[6]。

完整的乳蛋白原料可能具有不同程度致敏潛力,對于牛乳過敏的嬰幼兒來說,低過敏性牛乳配方是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。傳統(tǒng)的處理方法包括加熱、高壓和輻照等主要破壞蛋白的構(gòu)象表位,蛋白分子仍然完整或?yàn)榇蠓肿悠?降低酪蛋白效果可能不理想[7]。蛋白酶水解被認(rèn)為是在很大程度上降低以線性表位為主的酪蛋白過敏原性的最有效方法,可以通過改變蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合表位來增加或減少抗原活性[8]。然而,過度水解配方會(huì)降低乳蛋白功能價(jià)值[9]。因此,通過有效的酶解手段,實(shí)現(xiàn)既能消除蛋白過敏又能最大限度保留蛋白固有的特征,一直是學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界追求的目標(biāo)。

本文以嬰幼兒配方奶粉配料酪蛋白為研究對象,首先通過血清學(xué)評價(jià)方法分析5種不同來源酪蛋白結(jié)合牛乳過敏兒童血清IgG差異,然后對其中具有較高過敏原性的酪蛋白進(jìn)行蛋白酶水解,以期為消減乳中過敏原,開發(fā)低水解度下具有低致敏配方奶粉建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蛋白樣品來源

5種牛乳酪蛋白樣品分別來自北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司的酸法酪蛋白(編號CN1)和凝乳酶酪蛋白(編號CN3)、來自天津益健元生物科技有限公司的酸法酪蛋白(編號CN2)、來自北京多愛特生物科技有限公司的膠束酪蛋白(編號CN4)和酶法酪蛋白(編號CN5)。

1.2 血清樣品來源

從青島大學(xué)附屬醫(yī)院采集到12例牛乳過敏兒童IgG血清,經(jīng)篩選得到具有較高結(jié)合牛乳酪蛋白組分能力的血清6例,年齡1～6歲(平均年齡3.7歲),男3例,女3例,取6例血清等體積混合后用于酪蛋白過敏原性測定。采集正常兒童血清3例,年齡5～9歲(平均年齡7.0歲),男2例,女1例,使用時(shí)以3例血清等體積混合血清作為陰性對照。這項(xiàng)研究是根據(jù)《赫爾辛基宣言》進(jìn)行的,所有參與的兒童的監(jiān)護(hù)人均已知情同意。

1.3 主要材料與試劑

α-胰凝乳蛋白酶、TMB雙組分顯色液、ECL超敏發(fā)光液、PVDF膜,北京索萊寶生物科技有限公司；堿性蛋白酶,丹麥Novozymes公司；菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶,南寧龐博生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗人IgG,南京碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器與設(shè)備

Multiskan FC酶標(biāo)儀,美國Thermo Scientific公司；DYCZ-24F電泳儀,北京六一生物科技有限公司；Tanon 5200Multi凝膠成像發(fā)光儀,上海天能科技有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 蛋白含量測定

分別稱取酪蛋白0.100 8 g,溶于10 mL去離子水,加入蛋白質(zhì)量5%的無水Na2CO3并渦旋振蕩使酪蛋白完全溶解。各蛋白樣品稀釋1/50后用BCA法測定蛋白含量,具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 蛋白SDS-PAGE分析

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)法分析蛋白組成[10],稀釋樣品蛋白質(zhì)量濃度至2 mg/mL,分離膠12%,濃縮膠4%,蛋白樣品上樣量20 μL,蛋白Marker上樣量5 μL,利用凝膠成像儀拍照。

1.5.3 血清IgG結(jié)合酪蛋白能力測定

1.5.3.1 間接ELISA法

采用間接酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法測定酪蛋白樣品的過敏原性[11]。包被液稀釋蛋白為125 μg/mL后包被于96孔酶標(biāo)板,4 ℃過夜,洗板3次。加封閉液于37 ℃封閉2 h,結(jié)束后洗板。加稀釋1/1 600的患者血清于37 ℃溫育1 h,結(jié)束后洗板。加稀釋1/1 000的HRP-羊抗人IgG于37 ℃溫育30 min,結(jié)束后洗板。等體積的TMB底物A液和B液混勻加入酶標(biāo)板并37 ℃溫育5 min。加2 mol/L硫酸終止反應(yīng),15 min內(nèi)利用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。

1.5.3.2 免疫印跡法

采用免疫印跡法測定血清IgG與酪蛋白組分的結(jié)合特點(diǎn)[12]。按1.5.2制備SDS-PAGE凝膠,電泳結(jié)束轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)/TBST(Tris-HCl Tween 20)對PVDF膜封閉2 h,結(jié)束后洗滌3次。用稀釋1/1 600的血清將PVDF膜小條完全浸沒,4 ℃放置過夜,結(jié)束后洗滌3次。用稀釋1/4 000的HRP-羊抗人IgG室溫?fù)u床1 h,用TBST洗滌3次。取ECL超敏發(fā)光液A液與B液等體積混勻,用吸管吹打在膜上顯色2～5 min,凝膠成像儀拍照。

1.5.4 酪蛋白酶解

配制40 g/L酪蛋白溶液,用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)至各蛋白酶適宜pH后分別于各蛋白酶最適溫度(表1)的預(yù)熱30 min。待溫度和pH穩(wěn)定后,加入3 000 U/g蛋白酶進(jìn)行水解,使用1 mol/L HCl或NaOH溶液保持反應(yīng)溶液pH恒定。分別在不同反應(yīng)時(shí)間取出5 mL水解液,通過調(diào)節(jié)至不適pH阻斷酶解反應(yīng)[13],酶解結(jié)束后統(tǒng)一調(diào)節(jié)水解物pH為7.5左右,于-20 ℃儲(chǔ)存。

表1 各蛋白酶適宜反應(yīng)溫度和pHTable 1 Appropriate reaction temperature and pH for each enzyme

1.5.5 水解物殘留過敏原性測定

間接競爭性ELISA用于測定酪蛋白水解物的殘留過敏原性[14]。用包被液將未水解酪蛋白稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為125 μg/mL后加入到96孔酶標(biāo)板,4 ℃放置過夜,同時(shí)另取試管,水解樣品稀釋至125 μg/mL和稀釋1/1 600的血清等體積混合后4 ℃放置過夜。一抗溫育時(shí)所加樣品為水解液與血清的混合液,其余步驟具體方法同1.5.3.1。

1.5.6 水解物水解度測定

酪蛋白水解液稀釋1/200后采用茚三酮法測定酪蛋白水解物的水解度[15]。水解度的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：h,水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵物質(zhì)的量,mmol；htot,每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵物質(zhì)的量,mmol；酪蛋白為8.2 mmol/g。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,運(yùn)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析,顯著性差異(P<0.05)以不同字母表示,使用Origin 8.5軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源酪蛋白原料分析

測得5種不同來源酪蛋白溶液樣品的蛋白濃度及換算至酪蛋白原料中蛋白占比,結(jié)果如表2所示。5種不同來源酪蛋白中,酸法制備的酪蛋白CN1蛋白含量最高,為(8.72±0.22)mg/mL,原料中含量占比高達(dá)87.19%,其余4個(gè)酪蛋白樣品之間蛋白含量則無顯著差異。

表2 不同來源酪蛋白的蛋白含量測定結(jié)果Table 2 Protein content of casein from different sources

對5種不同來源酪蛋白的蛋白組成進(jìn)行蛋白電泳分析,如圖1所示。5種不同來源酪蛋白含有主要條帶酪蛋白,其中α-酪蛋白和β-酪蛋白含量高,κ-酪蛋白含量較低,除此之外,各酪蛋白樣品中均含有少量BSA組分。牛乳蛋白中酪蛋白含量占比高達(dá)80%,并且含有母乳中缺乏的β-乳球蛋白,與牛乳蛋白不同的是,母乳蛋白易被嬰幼兒和兒童消化吸收,能夠更多地被胃酸溶解和更快地從胃中排空[16]。

圖1 不同來源酪蛋白的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of casein from different sources 注：CN1和CN2為酸法酪蛋白,CN3和CN5為酶法酪蛋白, CN4為膠束酪蛋白；α-CN,β-CN,κ-CN依次為α-, β-和κ-酪蛋白,BSA為牛血清白蛋白(下同)

此外,母乳蛋白中酪蛋白含量較牛乳低且酪蛋白初級消化物酪蛋白磷酸肽則更有助于吸收,免疫球蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶等蛋白在胃腸道中具有初級免疫防御作用,這些不同之處也是牛乳蛋白作為母乳替代物卻容易引發(fā)過敏反應(yīng)的原因[17-18]。

2.2 不同來源酪蛋白樣品結(jié)合血清IgG能力分析

配方奶粉中的蛋白質(zhì)來源或加工方法可能會(huì)對其抗原反應(yīng)性有影響[6]。不同來源酪蛋白結(jié)合過敏兒童血清特異性IgG能力的間接ELISA分析如圖2所示。不同酪蛋白結(jié)合陰性血清具有差異,但吸光值均低于0.1,IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白,這也決定了可能在陰性血清中有不同酪蛋白結(jié)合IgG的位點(diǎn)[19]。而當(dāng)陽性血清吸光度與陰性血清吸光度之比大于2.1時(shí),陽性血清與陰性血清有顯著性差異[20]。從圖2可以看到,酪蛋白結(jié)合過敏兒童血清特異性IgG的能力均顯著高于結(jié)合陰性血清IgG的能力,說明該5種酪蛋白均具有一定過敏原性。凝乳酶酪蛋白CN3、膠束酪蛋白CN4和酶法酪蛋白CN5結(jié)合過敏血清特異性IgG能力無顯著差異,且結(jié)合能力均顯著高于酸法酪蛋白CN1和CN2。酪蛋白不同制備方法產(chǎn)生不同的穩(wěn)定性效果,酸法酪蛋白是通過添加鹽酸或硫酸等無機(jī)酸至酪蛋白等電點(diǎn)使其沉淀出來,而酶法酪蛋白采用凝乳酶從乳中提取酪蛋白,受凝乳基質(zhì)的阻礙,產(chǎn)生聚集的酪蛋白膠束,且β-酪蛋白不易解離,從而保證了酪蛋白的完整性和穩(wěn)定性[21-22]。因此,酶法制備的酪蛋白可能對抗原表位破壞少,結(jié)合過敏血清IgG能力較高,所以后續(xù)對酶法酪蛋白CN5采用蛋白酶水解消減過敏。

圖2 不同來源酪蛋白結(jié)合血清IgG的間接ELISA分析Fig.2 Indirect ELISA analysis of binding capacity of casein from different sources with serum IgG

在牛乳蛋白質(zhì)組中含有大量可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)的成分[23],對不同來源酪蛋白結(jié)合過敏兒童血清IgG的組分的免疫印跡分析如圖3所示。5種不同來源酪蛋白除主要組分酪蛋白與血清IgG特異結(jié)合外,還有部分乳清蛋白中的BSA結(jié)合血清IgG。有研究采用免疫印跡法對牛乳sIgG血清識別主要牛乳組分,得到血清sIgG主要識別的組分為α-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白和BSA[24]。說明了兒童牛乳過敏并非由單一牛乳蛋白組分導(dǎo)致,幾種牛乳蛋白組分都有作為過敏原的潛力。對于主要組分酪蛋白,結(jié)合血清特異性IgG最強(qiáng)烈的是CN3,其次為CN5,2種酪蛋白均為酶法制備的酪蛋白,而CN1和CN2兩種酸法制備的酪蛋白結(jié)合血清IgG效果次之,這與圖2的結(jié)果一致,即酶法制備的酪蛋白具有更高的過敏原性。酪蛋白在嬰幼兒配方奶粉的應(yīng)用通常是通過減少酪蛋白的含量來仿母乳化,一些嬰幼兒配方奶粉中,含35%的酪蛋白和65%的α-乳白蛋白的配方奶粉比100%乳清配方奶粉過敏反應(yīng)更低[25]。酪蛋白具有多個(gè)線性表位的IgG結(jié)合位點(diǎn),最主要結(jié)合α和β-酪蛋白,因此對酪蛋白過敏主要消減的蛋白組分為α和β-酪蛋白。

圖3 不同來源酪蛋白結(jié)合血清IgG的免疫印跡圖Fig.3 Western Blotting of casein from different sources binding with serum IgG

2.3 酪蛋白水解物殘留過敏原性和水解度分析

對不同來源酪蛋白結(jié)合IgG能力結(jié)果可知,酶法酪蛋白CN5具有更高的過敏原性,因此使用4種蛋白酶,α-胰凝乳蛋白酶(圖4-a)、堿性蛋白酶(圖4-b)、菠蘿蛋白酶(圖4-c)和木瓜蛋白酶(圖4-d)分別對酶法酪蛋白(CN5)進(jìn)行水解,取不同水解時(shí)間的水解物進(jìn)行水解度和殘留過敏原性結(jié)果如圖4所示。

a-α-胰凝乳蛋白酶；b-堿性蛋白酶；c-菠蘿蛋白酶；d-木瓜蛋白酶圖4 不同酶分別水解牛乳酪蛋白不同時(shí)間后水解物殘留過敏原性和水解度Fig.4 The residual antigenicity and degree of hydrolysis of cow’s milk casein hydrolyzed by different enzymes

水解度能夠評價(jià)水解過程中蛋白降解的程度。通過茚三酮法測定了酪蛋白水解產(chǎn)物的水解度,可以看出水解度曲線在加入蛋白酶后都表現(xiàn)出了較快的反應(yīng)速率,到后期增長緩慢。初期呈現(xiàn)較快的酶解反應(yīng)速率可能是因?yàn)榈鞍酌讣尤霑r(shí),酪蛋白序列中可供酶解的位點(diǎn)數(shù)目多,然后隨著反應(yīng)的進(jìn)行,可供酶解的位點(diǎn)數(shù)目少或蛋白酶活力下降,因此水解緩慢。α-胰凝乳蛋白酶水解酪蛋白120 min后開始趨向平緩,水解結(jié)束時(shí)最高的水解度為11%；堿性蛋白酶水解酪蛋白的水解度在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)始終較快速增長,且最高的水解度為47%；菠蘿蛋白酶前期反應(yīng)速度較慢,后期逐漸增長,最高水解度為8%；木瓜蛋白酶水解酪蛋白反應(yīng)自120 min后增長緩慢,最高水解度約5%。從結(jié)果可知,4種蛋白酶中堿性蛋白酶具有最高的水解度,可能是由于堿性蛋白酶具有廣泛的酶切位點(diǎn)[26]。

通過間接競爭ELISA測定了酪蛋白水解物的殘留過敏原性以評價(jià)蛋白酶對酪蛋白過敏的消減效果。從圖4可知,4種蛋白酶都有明顯降低酪蛋白過敏原性的效果,在反應(yīng)時(shí)間360 min內(nèi)殘留過敏原性隨著水解時(shí)間延長同樣會(huì)逐漸緩慢變化或出現(xiàn)平臺期,降低效果從高到低依次為菠蘿蛋白酶>木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>α-胰凝乳蛋白酶。α-胰凝乳蛋白酶水解酪蛋白的產(chǎn)物殘留過敏原性隨水解時(shí)間增加逐漸降低,240 min開始無顯著變化,殘留過敏原性為22%；堿性蛋白酶在反應(yīng)180 min內(nèi)對過敏原性降低效果較其他3種蛋白酶低,到240 min以后變化顯著,殘留過敏原性為15%；菠蘿蛋白酶水解酪蛋白的殘留過敏原性在反應(yīng)30 min就顯著降低至20%以下,至360 min殘留過敏原性降低到9%,反映出最好的消減效果；木瓜蛋白酶水解酪蛋白的產(chǎn)物殘留過敏原性從180 min開始出現(xiàn)平臺期,隨著反應(yīng)時(shí)間增加無明顯變化,殘留過敏原性降低到14%。有研究對αS1-酪蛋白進(jìn)行酶解時(shí),采用α-胰凝乳蛋白酶水解時(shí)殘留過敏原性為37%,胃蛋白酶分別在pH 2.2和5.5時(shí)殘留過敏原性為40%和62%[13]。一種絲氨酸蛋白酶用于水解α-酪蛋白時(shí),發(fā)現(xiàn)持續(xù)水解會(huì)產(chǎn)生新的過敏表位[27]。因此,本研究使用蛋白酶水解酪蛋白具有更顯著降低殘留致敏性的效果。

結(jié)合水解度和殘留過敏原性分析可以發(fā)現(xiàn),水解度較低的菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶反而具有最低的殘留過敏原性,這說明對于不同蛋白酶水解酪蛋白時(shí),水解度的高低并不能代表殘留過敏原性的高低,兩者沒有呈現(xiàn)正向關(guān)系,有研究在評估乳清蛋白水解物致敏性時(shí)也獲得類似的結(jié)果[6]。這種差異主要受蛋白酶特異水解酪蛋白位點(diǎn)的差異,從而影響降低酪蛋白抗原結(jié)合表位的效果。

2.4 酪蛋白水解物SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE反映4種蛋白酶水解酪蛋白不同時(shí)間水解產(chǎn)物的蛋白組分變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。未加入蛋白酶時(shí),蛋白條帶為完整的酪蛋白條帶,水解開始后,蛋白條帶發(fā)生明顯的變化,大分子蛋白逐漸被水解。α-胰凝乳蛋白酶和堿性蛋白酶水解酪蛋白(圖5-a)在180 min以內(nèi)水解物中明顯含有部分完整的α-酪蛋白,但從240 min開始完整蛋白幾乎被水解,這與在240和360 min殘留抗原性顯著降低的結(jié)果一致。從得到菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶水解酪蛋白(圖5-b)開始,各個(gè)過敏蛋白組分被水解,蛋白分子質(zhì)量降低,隨著水解不斷進(jìn)行,蛋白條帶逐漸變淺,且分子質(zhì)量集中區(qū)域往更低的區(qū)域遷移,說明隨著水解程度加深,大分子蛋白不斷被水解為小分子的多肽。

M-蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；CN-酪蛋白；α-α-胰凝乳蛋白酶； S-堿性蛋白酶；B-菠蘿蛋白酶；P-木瓜蛋白酶 a-α-胰凝乳蛋白酶、堿性蛋白酶；b-菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶圖5 不同酶分別水解牛乳酪蛋白不同時(shí)間后水解物的 SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE of cow’s milk casein hydrolyzed by different enzymes 注：字母旁邊的數(shù)字為水解時(shí)間,單位為min

3 結(jié)論

采用酶解法消減牛乳蛋白過敏原,生產(chǎn)低致敏性嬰幼兒配方奶粉是可行的解決途徑。本研究在對不同制備酪蛋白的過敏原性分析時(shí)均獲得了較高的過敏血清IgG結(jié)合能力,說明獲得的酪蛋白原料都具有過敏潛力,其中酶法制備的酪蛋白致敏潛力更高。對酶法酪蛋白針對性酶解得到,酶解可以有效消減牛乳中酪蛋白過敏,4種蛋白酶分別用于水解牛乳酪蛋白,隨著反應(yīng)時(shí)間增加酪蛋白殘留過敏原性均顯著降低并在反應(yīng)后期無明顯變化,α-胰凝乳蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶獲得殘留過敏原性依次為22%、15%、9%和14%,對應(yīng)水解度為11%、47%、8%和5%。盡管堿性蛋白酶水解酪蛋白能力強(qiáng),但消減過敏原能力不如菠蘿蛋白酶,因此,菠蘿蛋白酶可以實(shí)現(xiàn)低水解度下特異性消減牛乳酪蛋白過敏。在低致敏性嬰幼兒配方奶粉的設(shè)計(jì)中還需要進(jìn)一步考慮對水解物特性與營養(yǎng)學(xué)相關(guān)的評價(jià)。