肖懷秋,李玉珍,林親錄,趙謀明,周全,趙一純

1(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院,湖南 株洲,412000) 2(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙,410004) 3(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州,510000)

食源性致病菌是指在食品加工和流通過程中引入的致病病原菌,大腸桿菌(Escherichiacoli)是最常見的低感染劑量高致病性腸道病原體,可引起腹瀉和出血性結(jié)腸炎等疾病,是食品公共衛(wèi)生領(lǐng)域的嚴重威脅[1]。曹鐵紅等[2]監(jiān)測通化區(qū)農(nóng)貿(mào)市場銷售肉與肉制品食源性致病菌污染狀況發(fā)現(xiàn),E.coli檢出率為18.37%;國譯丹等[3]監(jiān)測云南省外賣餐飲微生物污染狀況發(fā)現(xiàn),E.coli檢出率為16.48%;張艷等[4]監(jiān)測南充市熟肉制品微生物污染情況發(fā)現(xiàn),E.coli檢出率為46.4%。由此可見,食品加工與流通環(huán)節(jié)易感染大腸桿菌并產(chǎn)生潛在安全風險。傳統(tǒng)熱處理殺菌方式會對食品熱敏性成分和色香味產(chǎn)生不良影響,人工防腐劑由于化學(xué)品使用量和使用條件的限制,應(yīng)用也受限?？咕臒岱€(wěn)定性好、抗菌活性高、生物毒副作用少且不易產(chǎn)生耐藥性,可作為食品防腐保鮮劑使用[1]。當前抗菌肽研究以膜損傷效應(yīng)靶點居多,主要是因為該靶點可解決現(xiàn)有抗生素難以徹底殺滅處于減速生長期與休眠期致病病原體的不足,細胞膜結(jié)構(gòu)相對保守且具備快速殺菌效應(yīng),且真核與原核細胞結(jié)構(gòu)差異使得抗菌肽具有較好細胞選擇性[5]。目前,抗菌劑以蛋白質(zhì)酶解制備的抗菌多肽研究較多[6-8],金屬抗菌肽研究鮮見,金屬抗菌肽是含有金屬離子的新型抗菌肽,除可以起到良好抗菌和抗氧化等生物活性外,還能為食品提供多肽營養(yǎng)與金屬離子,具有很好的研究價值。課題組發(fā)現(xiàn),金屬抗菌肽SIF4對金黃色葡萄球菌有良好抑菌活性[9],在模擬食品體系中能保持較好抑菌穩(wěn)定性[10],但抑菌機理尚不明確。探究SIF4對大腸桿菌的抑菌機理可為其在食源性大腸桿菌生物抑制的理論與應(yīng)用研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

1.1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40SAI蒸汽滅菌鍋,上海博迅公司；Sizer2000電位儀,Malvern；BBS-SSC超凈工作臺,濟南騰覽公司；DH-360恒溫培養(yǎng)箱,北京科偉公司；UV—2500紫外可見分光光度計,日本Shimadzu公司；TAS-990原子吸收光譜儀,北京普析公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)測定

準確吸取0.05×10-3～1.0 mg/L的SIF4溶液1.0 mL 加入培養(yǎng)皿中,倒入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基并混勻,凝固后準確吸取0.1 mL對數(shù)生長期E.coli(6×108CFU/mL)涂布于培養(yǎng)基表面,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落生長情況,菌落被完全抑制的最低濃度為MIC。

1.2.2 大腸桿菌抑菌生長曲線繪制

取對數(shù)生長期菌液于6 500 r/min離心10 min,菌體用10 mmol/L PBS(pH 7.4,下同)洗滌3次以除去殘留培養(yǎng)基和代謝物,PBS重新懸浮菌體使OD600 nm=0.5,加入SIF4使終質(zhì)量濃度分別為0.2 mg/L(1/2 MIC)、0.4 mg/L(MIC)和0.8 mg/L(2 MIC),37 ℃、130 r/min培養(yǎng)24 h,間隔2 h取樣測定OD600 nm,以未加SIF4的PBS組為對照組。

1.2.3 細胞壁通透性的測定

取對數(shù)生長期菌液6 500 r/min離心10 min,菌體用PBS沖洗3次并重懸(OD600 nm=0.5)。取重懸液50 mL加入SIF4使終濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC,未加SIF4為對照組。所有試驗組37 ℃、130 r/min溫育3 h,間隔0.5 h吸取5 mL菌懸液于6 500 r/min離心10 min,取上清液與0.5 mL 1 g/L PNPP溶液混勻,37 ℃暗處理30 min,加入0.2 mL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng),測定OD405 nm值[11]。

1.2.4 胞內(nèi)K+泄露的測定

取對數(shù)生長期菌液6 500 r/min離心10 min,用無菌去離子水洗滌菌體3次并重懸(OD600 nm=0.5),加入SIF4使終濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC,37 ℃溫育3 h,間隔30 min取樣,10 000 r/min離心10 min,測定上清液K+濃度,未加SIF4為陰性對照,Triton X-100(100 mg/L,下同)為陽性對照[12]。

1.2.5 胞內(nèi)生物大分子泄露的測定

取對數(shù)生長期菌液于6 500 r/min離心10 min,菌體用PBS洗滌3次并重懸(OD600 nm=0.5),加入SIF4使終濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC,37 ℃溫育5 h,間隔1 h取培養(yǎng)液5 mL,6 500 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm濾膜過濾并測定OD280 nm和OD260 nm。以PBS組和Triton X-100組為陰性和陽性對照[13]。

1.2.6 細胞表面疏水性的測定

取對數(shù)生長期菌液于6 500 r/min離心10 min,PBS洗滌菌體3次并用0.1 mol/L KNO3溶液(pH 6.2)重懸(OD600 nm=0.5),加入SIF4使終濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC,未加SIF4為對照組,37 ℃、130 r/min培養(yǎng)30 min后取出測定OD600 nm(A0)；取SIF4與菌體混懸液4.8 mL加入0.2 mL十六烷并充分混勻,室溫靜置30 min至完全分層后吸取水相測定OD600 nm(A1)[14]。表面疏水性用細菌吸附率(%)表示,按公式(1)計算：

(1)

1.2.7 細胞膜通透性的測定

1.2.8 細胞表面電位的測定

取對數(shù)生長期菌液于6 500 r/min離心10 min,用無菌超純水洗滌3次并重懸(OD600 nm為0.2～0.3),加SIF4至50 mL菌懸液中使終濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC,37 ℃溫育30 min,6 500 r/min離心10 min,菌體用無菌超純水重懸(OD600 nm=0.05),室溫下測定細胞表面電位。以無菌超純水組和Triton X-100組為陰性與陽性對照[15]。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理方法

試驗結(jié)果以表示(n=3),僅進行組間均數(shù)差異多重比較,采用SPSS 25.0進行單因素ANOVA分析,方差齊性時采用最小顯著差異法,非齊性時用塔姆黑尼T2法。

2 結(jié)果與分析

2.1 金屬抗菌肽SIF4最小抑菌濃度測定

SIF4對大腸桿菌的抑制效果如表1所示。對照組菌落數(shù)較多,SIF4濃度在0.05～0.3 mg/L時,菌落數(shù)隨SIF4濃度增加呈遞減趨勢,SIF4為0.4 mg/L或更高時未發(fā)現(xiàn)菌落生長,因此,SIF4對大腸桿菌的MIC為0.4 mg/L。

表1 SIF4對大腸桿菌生長抑制的影響Table 1 Inhibitory effect of SIF4 on the growth of E.coli

2.2 金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌抑菌生長的影響

SIF4對大腸桿菌抑菌曲線如圖1所示。由圖1可看出,對照組菌體對數(shù)生長期為10～12 h,16 h后進入衰亡期；1/2 MIC組培養(yǎng)14 h后進入衰亡期,比對照組提前約2 h；MIC組和2 MIC組培養(yǎng)12 h后進入衰亡期,菌體密度與對照組和1/2 MIC相比有顯著降低,衰亡期后細胞凋亡速度明顯快于對照組和1/2 MIC組。SIF4處理后菌體穩(wěn)定期與衰亡期均有不同程度提前,可誘導(dǎo)菌體提前凋亡。

圖1 SIF4對大腸桿菌的抑菌曲線Fig.1 Inhibitory curve of SIF4 against E.coli

2.3 金屬抗菌肽SIF4對細胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶是位于細胞周質(zhì)空間的胞內(nèi)非特異性磷酸單酯酶,是磷酸基團轉(zhuǎn)移、生物大分子合成及細胞分化等關(guān)鍵酶,可調(diào)控胞內(nèi)Ca2+,細胞壁受損時胞外可檢測到該酶,是細胞壁通透性的重要評價指標[16]。SIF4對細胞壁通透性影響如圖2所示。

圖2 SIF4對細胞壁通透性的影響Fig.2 Effect of SIF4 on cell wall permeability 注：字母相同者表示差異不顯著(P>0.05),字母不同者表示 差異顯著(P<0.05)(下同)

試驗組與對照組均存在顯著差異(P<0.05)。溫育0.5 h時,1/2 MIC、MIC和2MIC組間差異不顯著,可能是由于溫育30 min內(nèi)抗菌肽處于膜吸附階段；溫育1 h后,各試驗組間均存在顯著差異(P<0.05),細胞壁通透性與SIF4濃度和溫育時間呈正相關(guān)。SIF4對細胞壁的損傷可能是由于金屬抗菌肽SIF4結(jié)構(gòu)中的Fe2+能取代細胞壁表面Mg2+,或與細胞壁帶負電荷脂多糖結(jié)合,或結(jié)合到某特定負電荷區(qū)域使細胞壁結(jié)構(gòu)改變并使通透性增強[17],與李婷等[18]的結(jié)果一致。

2.4 金屬抗菌肽SIF4對胞內(nèi)K+泄露的影響

細胞膜受損后可使胞內(nèi)離子泄露并引起代謝紊亂,K+是離子泄漏的典型代表,小分子電解質(zhì)比核酸與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)優(yōu)先泄露[19]。SIF4對胞內(nèi)K+泄露的影響如圖3所示。

圖3 SIF4對胞內(nèi)K+泄露的影響Fig.3 Effect of SIF4 on intracellular K+ leakage

試驗組與對照組均有顯著差異(P<0.05),對照組胞外僅能檢測到極低濃度K+。胞內(nèi)K+泄露隨SIF4濃度升高和溫育時間延長呈遞增趨勢,各試驗組胞內(nèi)K+泄露有顯著差異(P<0.05),與唐文婷[12]的結(jié)果一致。試驗還發(fā)現(xiàn),2 MIC組與Triton X-100組差異不顯著,表明SIF4在2 MIC(0.8 mg/L)時與Triton X-100對胞內(nèi)K+泄露影響基本相同。細胞膜受損可破壞細胞膜K+離子通道并影響Na+-K+-ATP酶活性,使基于細胞膜轉(zhuǎn)運的代謝無法完成并誘導(dǎo)細胞提前程序性凋亡。

2.5 金屬抗菌肽SIF4對胞內(nèi)生物大分子泄露影響

a-核酸；b-蛋白質(zhì)圖4 SIF4對胞內(nèi)生物大分子泄露的影響Fig.4 Effect of SIF4 on intracellular macromolecular leakage

細胞膜受損除引起胞內(nèi)離子與小分子物質(zhì)泄漏外,還會誘導(dǎo)胞內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)等生物大分子泄露,核酸與蛋白質(zhì)分別在260和280 nm處有特征性紫外吸收,測定這2處波長光吸收值可監(jiān)測胞內(nèi)生物大分子泄露狀態(tài)[20]。SIF4對胞內(nèi)生物大分子泄露影響如圖4所示。溫育1 h時,1/2 MIC組與對照組無顯著差異,可能是由于溫育60 min內(nèi)主要為膜吸附階段,并未引發(fā)細胞膜受損,溫育2 h后,試驗組與對照組均存在顯著差異(P<0.05)。隨著SIF4濃度升高與溫育時間延長,胞內(nèi)生物大分子泄露呈遞增趨勢,表明SIF4能破壞細胞膜并增強膜滲透性,推斷細胞膜可能是金屬抗菌肽SIF4抗菌效應(yīng)靶點,與戴錦銘[21]的結(jié)果一致。研究還發(fā)現(xiàn),2 MIC組與Triton X-100組差異均不顯著,表明2 MIC組對細胞膜損傷與Triton X-100相似,Triton X-100為雙親和結(jié)構(gòu),可將膜蛋白解離,對細胞膜破壞性比較強[22]。

2.6 金屬抗菌肽SIF4對細胞表面疏水性的影響

細胞表面疏水性是影響細菌非特異性粘附到其它物質(zhì)或界面的重要因素[23]。正十六烷是一種對細胞無損傷的疏水性溶劑,對菌體吸附率改變可表征細胞表面疏水性變化。SIF4對細胞表面疏水性影響如表2所示。

表2 SIF4對細胞表面疏水性的影響 單位：%

試驗組與對照組有顯著差異(P<0.05)。表面疏水性隨SIF4濃度增加顯著遞增(P<0.05),可能是由于金屬抗菌肽結(jié)構(gòu)中的Fe2+通過靜電作用吸附在帶負電荷細菌表面,使疏水域暴露并增強表面疏水性。大腸桿菌等電點pI為4.4,試驗所用KNO3緩沖液pH值(pH 6.2)高于大腸桿菌pI,細菌帶負電荷,有助于抗菌肽與菌體表面靜電吸附,吸引電負性基團造成重排并增強表面疏水性。表面疏水性增強可誘導(dǎo)細胞膜混亂,疏水性越強膜損傷越嚴重[24],與LEE等[25]結(jié)果一致,但與趙清風等[26]研究相悖,可能是由于Ag+與SIF4抗菌機制不同。

2.7 金屬抗菌肽SIF4對細胞膜通透性的影響

大腸桿菌在以乳糖為唯一碳源時可誘導(dǎo)生成β-半乳糖苷酶,細胞膜受損后,胞外ONPG可滲透入胞內(nèi)并被水解為半乳糖和鄰-硝基苯酚(o-nitrophenol,ONP),ONP在415 nm處有特征性紫外吸收。一定濃度范圍時,ONP吸光值與細胞膜通透性成正比,可作為細胞膜通透性評價的重要指標[27]。SIF4對細胞膜通透性影響如圖5所示。

圖5 SIF4對細胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of SIF4 on CMP

溫育1～3 h時,1/2 MIC組與對照組無顯著差異,可能是由于抗菌肽濃度較低,2 MIC組和MIC組及1/2 MIC有顯著差異(P<0.05),推測細胞膜損傷可能以“毯式模型”進行,SIF4疏水端通過靜電吸附聚集在細胞膜表面形成“毯式”結(jié)構(gòu),當集聚在細胞膜表面抗菌肽濃度達到閾值后,可由“毯式模型”破壞細胞膜結(jié)構(gòu)并造成細胞膜瞬間坍塌而引起膜破裂,作用于G-菌的抗菌肽常以“毯式模型”方式進行[5]。溫育4～5 h,1/2 MIC與對照組也存在顯著差異(P<0.05),可能是由于溫育時間較長時,SIF4逐步靜電吸附到細胞膜表面并達到抗菌閾值[6]。研究還發(fā)現(xiàn),溫育1 h后,MIC和2 MIC組與對照組有顯著差異(P<0.05),可能是由于MIC或2 MIC濃度時,靜電吸附并聚集在膜上抗菌肽可很快達到抗菌閾值[6]。

2.8 金屬抗菌肽SIF4對細胞表面zeta電位影響

表面電位絕對值越小菌體越易發(fā)生聚沉和黏附,常用zeta電位表征[28]。SIF4對細胞表面zeta電位影響如圖6所示。

圖6 SIF4對細胞表面zeta電位的影響Fig.6 Effect of SIF4 on cell surface zeta potential

由圖6可知,試驗組zeta電位與對照組有顯著差異(P<0.05)；細胞表面zeta電位(y)與SIF4濃度(x)呈負相關(guān)(y=24.06x-31.59,R2=0.907 4)。通常情況下,zeta電位0～±5 mV時菌體易凝聚,±10～±30 mV不穩(wěn)定,±30～±40 mV或更大有良好穩(wěn)定性[29]。1/2 MIC組zeta電位為(-27.28±1.19)mV,菌體開始表現(xiàn)不穩(wěn)定,MIC組和2 MIC組zeta電位分別上升至(-18.82±1.20)mV和(-13.66±1.26)mV,表明菌體穩(wěn)定性變差,2 MIC組與Triton X-100組差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

細胞壁(膜)結(jié)構(gòu)的完整對維持細胞形態(tài)與胞內(nèi)環(huán)境有重要作用,受損時可引起細胞通透性增強甚至出現(xiàn)不可逆孔洞,造成胞內(nèi)離子及生物大分子物質(zhì)泄露并誘導(dǎo)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),SIF4對大腸桿菌有較好抑菌活性,可破壞其細胞壁(膜)結(jié)構(gòu)并引起胞內(nèi)K+和生物大分子泄露,使菌體代謝紊亂并誘導(dǎo)菌體凋亡。SIF4處理后能增強表面疏水性,引起細胞膜混亂并導(dǎo)致膜受損,還能影響細胞表面zeta電位,使菌體聚沉和黏附,推測大腸桿菌細胞膜損傷以“毯式模型”進行。研究認為,大腸桿菌菌體表面帶負電荷,SIF4為陽離子抗菌肽[9],可通過靜電吸附聚集在菌體表面并干擾膜電位,以“毯式模型”破壞細胞膜結(jié)構(gòu),造成細胞聚沉和代謝紊亂,誘導(dǎo)菌體凋亡,SIF4可作為一種潛在的新型食品抗菌劑用于致病性大腸桿菌的生物抑制。