劉藝茹,馬霞,趙婷,劉錦浲,于學健,劉偉賢,程坤, 張欣,曹艷花,辛迪,馮慧軍,劉福東,趙雯,洪維鍊,姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,北京,100015) 2(內(nèi)蒙古乳業(yè)技術研究院有限責任公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010110) 3(內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010110)

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)廣泛存在于干酪、發(fā)酵乳、泡菜等發(fā)酵食品,以及人體的口腔、腸道之中,兼性厭氧,不運動不產(chǎn)生芽胞,具備長久的安全使用歷史,已被列入我國《可用于食品菌種名單》和歐盟安全資格認定(EU Safety Qualification,QPS)名單中。研究表明L.paracasei等益生菌的功能性和安全性特征在菌株水平具有特異性[1-4]。目前已有多株商業(yè)化菌株在乳制品、固體飲料制品、保健食品等領域廣泛應用,其在功能性、安全性等方面存在較大差異。L.paracaseiK56和ET-22是分別分離自兒童和成人腸道的益生菌,耐胃酸和耐腸液性能良好,具有調(diào)節(jié)免疫、緩解腸道炎癥、平衡腸道菌群、緩解便秘等功效,在發(fā)酵乳、固體飲料及保健食品等領域具有廣泛的應用潛力[5-7]。

副干酪乳桿菌所屬的乳桿菌屬(Lactobacillus)作為一類重要的益生菌資源,在全球健康食品工業(yè)中占據(jù)著重要地位。乳桿菌屬分類學地位已發(fā)生重要變遷,原乳桿菌屬被重新劃分為25個屬,本研究中涉及的L.paracasei變遷為副干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillusparacasei)[8],考慮到新分類單元的應用存在過渡期,本項目研究仍沿用之前的乳桿菌屬國際分類體系。新的分類方法更精確的描述了菌種的共同特征,有助于乳桿菌屬在各領域的研發(fā)創(chuàng)新和資源挖掘與利用,有助于促進相關產(chǎn)品的政府監(jiān)管和國際貿(mào)易發(fā)展,將對我國相關法規(guī)和乳制品行業(yè)應用產(chǎn)生深遠的影響。

益生菌產(chǎn)品形式豐富多樣,對益生菌在菌株水平的準確鑒定是確保其功能開發(fā)和安全性研究的重要前提,但目前國內(nèi)外關于益生菌菌株水平鑒定的技術方法和明確判定標準仍處于起步階段,建立完善的菌株水平鑒定技術體系是行業(yè)發(fā)展的重點趨勢。益生菌菌株水平鑒定通常在菌種水平鑒定的基礎上開展[9],菌種水平分類學地位的確認通過多相鑒定進行,通常包括菌落菌體形態(tài)、生理生化特征分析(如：VITEK、API、BIOLOG)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)等表型鑒定方法,以及16S rRNA基因、pheS/atpD功能基因、平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)分析等基因型鑒定方法[10-13]?；谌蚪M測序(whole genome sequencing,WGS)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析和多位點測序分型(multi-site sequencing for typing,MLST)分析技術憑借其全面的遺傳信息和較高的分辨率成為菌株分型鑒定的可靠方法[14-17],但目前仍缺乏WGS技術用于益生菌菌株鑒定的判定標準。本研究針對副干酪乳桿菌L.paracaseiK56和ET-22,通過形態(tài)學、生理生化等表型鑒定技術,結(jié)合WGS、MLST技術、單核苷酸多態(tài)性分析等分子生物學技術,開展L.paracasei菌株水平鑒定研究,實現(xiàn)了L.paracaseiK56和ET-22菌株水平區(qū)分,通過菌株水平鑒定實現(xiàn)益生菌的精準溯源,為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供可靠的技術標準,同時為政府監(jiān)管、行業(yè)標準法規(guī)制定提供技術參考,對促進益生菌在食品行業(yè)更加安全和廣泛的應用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

副干酪乳桿菌L.paracaseiK56和ET-22,內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司;模式菌株LactobacilluscaseiCICC 6117T和LactobacillusparacaseiJCM 8130T,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。其他7株參考菌株分離自有明確菌株聲稱的乳飲料、滴劑及菌劑等產(chǎn)品。菌株具體信息見表1。

表1 菌株信息Table 1 Information of selected strains

1.1.2 實驗儀器

ECLIPSE 80i光學顯微鏡,尼康儀器(上海)有限公司；隔水式培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司；Hitachi SU8010掃描電鏡,日立高新技術(上海)國際貿(mào)易有限公司；BAL-TEC SCD005噴金-離子濺射儀；MALDI-TOF MS儀,德國布魯克公司；BGISEQ-500高通量基因測序儀、BGIDL-50全自動樣本加載系統(tǒng),深圳華大智造科技有限公司；微量可調(diào)移液器、小型臺式冷凍離心機,德國Eppendorf公司；高壓滅菌鍋,日本HIRAYAMA公司；Q800R2超聲打斷儀,美國Sonicator公司；Qubit 3.0核酸熒光定量儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.3 實驗試劑

MRS瓊脂、強化梭菌培養(yǎng)基,美國BD公司；API 50 CHL培養(yǎng)基、API 50 CHL試驗條,法國生物梅里埃公司；革蘭氏染色液、0.85%生理鹽水,北京陸橋技術股份有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋,日本三菱化學公司；溶菌酶、RNase A溶液、GoldView、瓊脂糖,北京全式金生物技術有限公司；高通量測序試劑套裝BGISEQ-500RS(PE100)、MGIEasy通用DNA文庫制備試劑套裝,深圳華大智造科技有限公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit、Qubit?ssDNA Assay Kit,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit,Omega Bio-tek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態(tài)學觀察

采用4區(qū)劃線法將菌株K56和ET-22接種于MRS培養(yǎng)基平皿,于36 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h后,觀察記錄菌落特征,并進行革蘭氏染色觀察記錄菌體特征。菌株K56和ET-22經(jīng)無菌生理鹽水漂洗后用戊二醛固定過夜,將漂洗后的菌體加入到濾紙包中,乙醇梯度脫水,二氧化碳臨界點干燥后,將樣品放置到噴金-離子濺射儀中進行噴金,使用掃描電鏡進行菌體特征觀察。

1.2.2 API分析

將菌株K56和ET-22接種于MRS培養(yǎng)基平皿中,在36 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h,用無菌棉簽挑取足量菌落加入API 50 CHL培養(yǎng)基中制得混濁度相當于3 McFarland的菌懸液,接種API 50 CHL實驗條,于36 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h后,加入附加試劑判讀結(jié)果。試驗條判讀結(jié)果使用數(shù)據(jù)庫API 50 CHL V3.0進行鑒定。

1.2.3 MALDI-TOF MS鑒定

采用甲酸萃取法制備檢測樣本,分別挑取培養(yǎng)皿中各菌株菌體,混勻于300 μL超純水中,添加900 μL無水乙醇充分振蕩,離心菌體并去除上清液,完全去除乙醇后,用50 μL 70%甲醇重懸菌體細胞,再加入50 μL乙腈,通過移液槍反復吹打混合懸液；將制備的懸液按照MALDI-TOF MS檢測規(guī)程進行鑒定分析,確定菌株種水平分類學地位。

1.2.4 WGS及分析

1.2.4.1 菌株DNA提取及測序

按照細菌基因組DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit操作規(guī)程提取各菌株基因組DNA,使用MGIEasy通用DNA文庫制備試劑套裝進行建庫,將符合出庫標準的文庫按照BGISEQ-500RS高通量測序試劑套裝的說明書完成DNA納米球的制備、加載和上機測序。使用SOAPnuke v1.5.6對下機原始數(shù)據(jù)進行過濾,去除接頭序列、PCR重復序列、和低質(zhì)量堿基序列(Phred得分<20),利用SPAdes v3.11.0進行序列拼接,獲得組裝基因組序列[18-19]。

1.2.4.2 菌株ANI分析

以模式菌株Lactobacillusparacaseisubsp.paracaseiJCM 8130T(GCF_000829035.1)、Lactobacillusparacaseisubsp.toleransDSM 20258T(GCF_001436485.1)為參考菌株,利用fastaANI(v 1.3)軟件對測序菌株進行ANI分析。

1.2.4.3 基于WGS的多基因序列位點分析(whole genome multilocus sequence typing,wgMLST)

使用Prodigal 2.6.3預測樣品基因組序列中的編碼基因,獲得編碼基因的核酸序列與蛋白質(zhì)序列。利用CD-HIT v4.6.6對編碼基因進行聚類分析,提取各樣品中均存在的共有基因。采用TreeBeST(v 1.9.2)的PHYML(最大似然法)算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,bootstraps參數(shù)設置為1 000。

1.2.4.4 SNP分析

通過MUMmer 比對軟件,將每個樣品與參考序列進行比對,篩選潛在SNP位點。提取參考序列SNP位點兩邊各100 bp序列,用BLAT將提取的序列和組裝結(jié)果進行比對,進行SNP位點驗證。采用BLAST、TRF、Repeatmask軟件預測重復序列位點,過濾去除重復區(qū)SNP,最后得到可靠的SNP。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學觀察

菌株K56在MRS培養(yǎng)基上36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,菌落白色、圓形,表面濕潤,不透明,邊緣整齊(圖1-a)；光學顯微鏡下觀察,菌體呈桿狀,(0.4～0.5)μm×(0.9～3.2)μm,單個或成對排列,革蘭氏陽性(圖1-b)。掃描電鏡觀察,菌體呈桿狀,菌體呈桿狀,(0.4～0.5)μm×(0.9～1.8)μm,單個或成對排列(圖1-c)。菌株K56的菌落和菌體形態(tài)符合副干酪乳桿菌特征[20]。

a-菌落形態(tài)；b-菌體顯微形態(tài)；c-菌體掃描電鏡形態(tài)圖1 菌株K56菌落和菌體形態(tài)Fig.1 Colony and morphology of strain K56

菌株ET-22在MRS培養(yǎng)基上36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,菌落白色、圓形,表面濕潤,不透明,邊緣整齊(圖2-a)；光學顯微鏡下觀察,菌體呈桿狀,(0.5～0.6)μm×(0.9～2.7)μm,單個或成對排列,革蘭氏陽性(圖2-b)。掃描電鏡觀察,菌體呈桿狀,(0.5～0.6)μm×(1.2～3.1)μm,單個或成對排列(圖2-c)。菌株ET-22的菌落和菌體形態(tài)符合副干酪乳桿菌特征。

a-菌落形態(tài)；b-菌體顯微形態(tài)；c-菌體掃描電鏡形態(tài)圖2 菌株ET-22菌落和菌體形態(tài)Fig.2 Colony and morphology of strain ET-22

2.2 API鑒定結(jié)果

菌株K56和ET-22的API生理生化結(jié)果如表2所示。菌株K56經(jīng)API 50 CHL系統(tǒng)鑒定為副干酪乳桿菌副干酪亞種,鑒定百分率為99.7%,T值為0.54；菌株ET-22經(jīng)API 50 CHL系統(tǒng)鑒定為副干酪乳桿菌副干酪亞種(Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei),鑒定百分率為89.0%,T值為0.43。

API微生物鑒定系統(tǒng)根據(jù)微生物對各種生理條件、生化指標代謝反應進行分析,并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為軟件可識別的數(shù)據(jù)進行聚類分析,與已知的參比菌株數(shù)據(jù)庫進行比較,最終實現(xiàn)對未知菌株的鑒定[21],其結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中收錄的菌株種類與數(shù)量密切相關,本研究中目標菌株K56和ET-22鑒定至亞種水平,與鑒定系統(tǒng)中生理生化反應及數(shù)據(jù)庫中菌株收集的數(shù)量有關,API鑒定系統(tǒng)提供的代謝特征還可為后續(xù)菌株功能開發(fā)提供有效支撐。

表2 菌株K56和ET-22的API分析結(jié)果Table 2 API analysis results of strain K56 and ET-22

2.3 菌株K56和ET-22及參考菌株MALDI-TOF MS鑒定

本研究通過MALDI-TOF MS鑒定,確定菌株K56、ET-22和參考菌株的種水平分類學地位。MALDI-TOF是近年來新興的微生物快速鑒定系統(tǒng),通過檢測微生物核糖體等高豐度穩(wěn)定表達的特征蛋白指紋圖譜,與已知微生物菌種蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫比對分析后,進行快速菌種鑒定,該方法已進入國家標準GB/T 33682—2017[10],在工業(yè)微生物(含乳桿菌屬和雙歧桿菌屬)菌種鑒定方面有較好的應用效果[22]。本研究應用的MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫中目前包含119種乳桿菌屬菌株圖譜,其中副干酪乳桿菌數(shù)據(jù)有15株,通過MALDI-TOF MS鑒定表明,各試驗菌株與數(shù)據(jù)庫中標準菌株核糖體蛋白圖譜的鑒定比對值達到2以上,專屬菌株及參考菌株均鑒定為副干酪乳桿菌Lactobacillusparacasei(表3),干酪乳桿菌LactobacilluscaseiCICC 6117T鑒定為干酪乳桿菌Lactobacilluscasei,其中干酪乳桿菌LactobacilluscaseiB經(jīng)鑒定為副干酪乳桿菌Lactobacillusparacasei,這種隨科技進步導致的分類學地位變遷是常見的現(xiàn)象,也表明了益生菌菌株分類學的進步和規(guī)范化發(fā)展。鑒定結(jié)果具有較高的可信度,進一步表明目標菌株K56和ET-22及相關參考菌株具備準確的種水平分類學地位。

2.4 ANI分析

對菌株K56、ET-22和參考菌株進行WGS分析,測序結(jié)果顯示試驗菌株測序深度大于300×,全基因組序列Q30均在90%以上,滿足后續(xù)組裝及分析要求。ANI于2007年由GORIS等[12]提出,通過比較大量模式菌株的兩兩基因組指出2個基因組序列之間的整體相似性,ANI值95%～96%與DNA-DNA雜交值的70%相對應,可作為細菌物種鑒定的有效方法。選取模式菌株L.paracaseisubsp.paracaseiJCM 8130T(ref1)和L.paracaseisubsp.toleransDSM 20258T(ref2)的全基因組序列作為參考序列進行ANI分析。結(jié)果表明,不同L.paracasei菌株與模式菌株全基因組序列的ANI值均達到95%以上(表4),其中菌株ET-22-D1和K56-D1為目標菌株的原始菌株,菌株ET-22-D2和K56-D2分別為對應菌株傳代培養(yǎng)5代的菌株。符合同菌種分類學地位的評判標準,菌株K56和ET-22及相關參考菌株均鑒定為副干酪乳桿菌(L.paracasei)。

表3 不同L.paracasei菌株的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果Table 3 MALDI-TOF MS results of different L.paracasei strains

表4 不同L.paracasei的ANI分析結(jié)果Table 4 ANI analysis results of different L.paracasei strains

綜上,結(jié)合形態(tài)學、生理生化(API)、MALDI-TOF MS和WGS ANI方法對菌株K56和ET-22種水平分類學地位進行了鑒定。通過MALDI-TOF MS和WGS ANI可得到目標菌株K56和ET-22及相關參考菌株明確的菌種水平分類學地位,形態(tài)學、生理生化(API)雖然不能對菌株進行精確鑒定,但其提供的菌株形態(tài)及代謝特征可為后續(xù)菌株功能開發(fā)、高密度培養(yǎng)、高效制造等提供有效支撐。

2.5 wgMLST分析

經(jīng)過wgMLST分析得到各L.paracasei菌株的核心基因共有1 701個(圖3),以共有基因為基礎,開展wgMLST分析(圖4)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,菌株K56和ET-22的序列分別處于同一分支,系統(tǒng)發(fā)育中Bootstrap值達99%以上,具備更近的親緣關系,該方法可有效區(qū)分菌株K56和ET-22與本研究中的其他參考菌株。MLST是基于多位點序列分型的菌株分型方法,是一種基于核酸序列測定的微生物分型方法,通過串聯(lián)多個基因內(nèi)部片段序列,對菌株的等位基因進行多樣性的比較,通過不同的序列型分析菌株間的關系,在流行病學監(jiān)測和進化研究方面有較廣泛的應用。傳統(tǒng)的MLST方法依托PCR擴增少數(shù)持家基因進行序列分析,由于選擇的基因數(shù)量較少,可能不能得到較好的菌株區(qū)分效果[23-24]。wgMLST方法主要通過對菌株間的所有共有基因進行差異分析和系統(tǒng)發(fā)育分析來實現(xiàn)菌株分型鑒定。DURANTI等[16]對18株青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)進行全基因測序和wgMLST分析,結(jié)果表明通過對872個共有基因的進行差異分析和系統(tǒng)發(fā)育分析,不同株青春雙歧桿菌(B.adolescentis)可得到良好區(qū)分。本研究中通過全基因組序列數(shù)據(jù)分析,選取專屬菌株和參考菌株的1 701個共有基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析,可將目標菌株K56和ET-22與參考菌株進行有效區(qū)分。

圖3 實驗菌株序列的共有基因分布Fig.3 Distribution of common genes in experimental strains

圖4 基于wgMLST的L.paracasei系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of L.paracasei strains based on wgMLST

2.6 SNP分析

單核苷酸多態(tài)性主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,具備數(shù)量豐富、分辨率高、覆蓋基因組范圍大、遺傳穩(wěn)定等特點,可作為較穩(wěn)定的遺傳標記應用于微生物菌株的分型溯源分析[25]。分別以副干酪乳桿菌K56和ET-22的基因組序列為參考,SNP分析結(jié)果如表5和表6所示。

表5 L.paracasei K56及參考菌株的SNP分析結(jié)果Table 5 SNP analysis results of L.paracasei K56 and reference strains

表6 L.paracasei ET-22及參考菌株的SNP分析結(jié)果Table 6 SNP analysis results of L.paracasei ET-22 and reference strains

菌株K56基因序列與參考序列相比,其SNP差異為103,其余副干酪乳桿菌菌株與參考基因組的SNP差異均大于129,菌株ET-22基因序列與參考序列相比,其SNP差異為49,其余副干酪乳桿菌菌株與參考基因組的SNP差異均大于225。表明菌株K56和ET-22可與8株副干酪乳桿菌菌株良好區(qū)分。基于SNP差異的系統(tǒng)發(fā)育分析也顯示K56和ET-22的基因序列分別聚集在同一分支,可與其他菌株進行明顯區(qū)分(圖5～圖6)。通過對大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等致病菌的SNP分析研究表明,21個SNP差異是判斷同一菌株的標準之一[25],SNP分析在益生菌領域的研究主要包括乳桿菌、雙歧桿菌等不同菌株的分型分析,但目前還未有關于益生菌同株的評判標準,該方法的判定標準與目標菌株及參考菌株的種類與數(shù)量密切相關,基于目前的菌株數(shù)量及數(shù)據(jù)結(jié)果分析,SNP分析可有效實現(xiàn)LactobacillusparacaseiK56和ET-22的株水平分型及鑒定。

圖5 基于SNP的副干酪乳桿菌L. paracasei K56系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of L. paracasei K56 and reference strains based on wg SNP

圖6 基于SNP的副干酪乳桿菌L.paracasei ET-22 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of L.paracasei ET-22 and reference strains based on SNP

3 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學、生理生化(API)、MALDI-TOF鑒定和WGS ANI方法可將菌株K56和ET-22鑒定為副干酪乳桿菌L.paracasei；進一步通過SNP和wgMLST可有效區(qū)分副干酪乳桿菌L.paracaseiK56和ET-22與本研究中的其他菌株。本研究L.paracaseiK56和ET-22菌株水平鑒定的技術流程,為益生菌菌株水平的精確鑒定技術體系的構(gòu)建提供了有效數(shù)據(jù)支撐和實踐。wgSNP和wgMLST作為分辨率較高的益生菌菌株水平鑒定技術,其適用范圍、判定標準與研究涵蓋的目標菌株、參考菌株數(shù)量密切相關。隨著試驗菌株樣本量的不斷擴充,建立的益生菌菌株水平鑒定流程和評價標準將更具代表性、覆蓋度和統(tǒng)計學意義。