TIN Hoe Seng,周斌,侯莎,吳昌正,黃磊,周其洋*

1(廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司,廣東 佛山,528000) 2(佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司,廣東 佛山,528500)

醬油是起源于我國(guó)的釀造調(diào)味品,已有數(shù)百年的產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史,后傳入韓國(guó)、日本,現(xiàn)已在國(guó)際市場(chǎng)上獲得了歐美地區(qū)消費(fèi)者的認(rèn)可。嶺南區(qū)日照充裕、氣溫較高,形成了醬油高鹽稀態(tài)釀造工藝,這種工藝生產(chǎn)出的醬油味道鮮美、香味濃郁,在居民飲食中具有較高接受度。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及人民生活水平提高,民眾對(duì)于醬油這一必備調(diào)味品的品質(zhì)及健康也有了更高、更多樣化的需求。《中國(guó)居民膳食指南》推薦[1]：健康成人每人每天食鹽攝入量不超過(guò)6 g；2～3歲幼兒攝入量不超過(guò)2 g；4～6歲幼兒不超過(guò)3 g；7～10歲兒童不超過(guò)4 g；65歲以上老人不超過(guò)5 g。因此,低鹽是健康需求的新發(fā)展動(dòng)向,高鹽稀態(tài)醬油減鹽發(fā)酵也已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì),但現(xiàn)有技術(shù)存在基礎(chǔ)研究依然薄弱。高鹽稀態(tài)工藝包括制曲和發(fā)酵2個(gè)階段,大豆/豆粕蒸煮后與小麥/麩皮混合,接入米曲霉進(jìn)行固態(tài)制曲,完成后注入高濃度鹽水進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵[2]。其中微生物扮演著極為重要的角色：制曲階段,米曲霉產(chǎn)生的中性蛋白酶、酸性蛋白酶及纖維酶等,對(duì)曲料中的生物大分子物質(zhì)進(jìn)行初步水解;液態(tài)發(fā)酵階段,醬醪中耐鹽酵母菌與耐鹽乳酸菌等多菌種產(chǎn)生更多酶系進(jìn)一步對(duì)原料進(jìn)行水解,生成更多的風(fēng)味物質(zhì),包括氨基酸、肽、酮、醛、酸、酯、酚等;經(jīng)過(guò)長(zhǎng)周期的發(fā)酵,最終形成滋味和香氣完美融合的嶺南醬油[3-4]。這其中鹽分對(duì)于發(fā)酵過(guò)程和產(chǎn)品風(fēng)味至關(guān)重要：一是防腐抑菌作用,淘汰非耐鹽性野生雜菌或有害微生物,這一作用主要通過(guò)降低發(fā)酵體系水活度,提高滲透壓來(lái)實(shí)現(xiàn)[5],如沙門氏菌及大腸桿菌能夠耐受的最低水分活度為0.95(相當(dāng)于80～90 g/L的食鹽含量)[6-7];此外,高濃度氯離子也能夠有效抑制有害微生物的滋生[8],使得醬油能夠安全的生產(chǎn)[9]。二是形成有效的有益微生物篩選機(jī)制[6]；與醬油風(fēng)味形成密切相關(guān)的嗜鹽四鏈球菌(Tetragenococcushalophilus)能夠耐受26%的高鹽環(huán)境[10-11],魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)及易變球擬酵母(Torulopsisversatilis)分別能夠耐受180 g/L及250 g/L的食鹽含量[12-13]。三是高濃度鹽帶來(lái)的咸味是醬油風(fēng)味口感協(xié)調(diào)不可缺少因素；據(jù)報(bào)道,醬油的口感很大程度上取決于咸味及鮮味的平衡,咸味能夠抑制苦味,提高鮮味[14]。醬油中咸味的缺乏在一定程度上破壞了醬油產(chǎn)品的總體風(fēng)味及協(xié)調(diào)性,造成風(fēng)味寡淡,影響感官品質(zhì)。高鹽稀態(tài)醬油醬醪通常醬醪中的鹽分達(dá)到160～180 g/L,以維持菌群和風(fēng)味的平衡,而低鹽醬油釀造工藝也就會(huì)面臨著高微生物污染及風(fēng)味不協(xié)調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。CHUN等[15]報(bào)道了在韓式大醬醬醪的發(fā)酵中,90 g/L鹽度大醬的pH值和有機(jī)酸變化遠(yuǎn)大于120、150和170 g/L鹽度的大醬。

本課題對(duì)高鹽稀態(tài)醬油不同鹽濃度條件下發(fā)酵微生物菌落結(jié)構(gòu)特征、變化規(guī)律及其對(duì)醬油理化指標(biāo)和風(fēng)味的影響進(jìn)行研究分析,以期通過(guò)基礎(chǔ)研究結(jié)果指引高鹽稀態(tài)醬油減鹽發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)一步升級(jí)開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用曲料樣品均取自佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司。

表1 材料信息Table 1 Material information

發(fā)酵工藝：將成曲用研缽碾碎,與鹽水以體積比1.0∶2.0混合。設(shè)置3個(gè)初始鹽度組,分別編號(hào)為L(zhǎng)、M、H,其初始鹽水質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)如下：第1組-13.7 g/100 mL、第2組-16.6 g/100 mL、第3組-20.4 g/100 mL。醬醪最終食鹽含量約為120、150、170 g/L。將混合后的醬醪分裝入2 L壇子中,不控溫的情況下發(fā)酵55 d,期間每天攪拌1次。發(fā)酵第5天(I)、第25天(II)、第55天(III)移取各組醬醪樣品,-20 ℃冰箱中保存待用。

土壤基因組提取試劑盒,美國(guó)MoBio公司；Qubit?dsDNA HS分析試劑盒,美國(guó)Thermo Fisher公司；SYBR?Premix Ex TaqTM II及配套產(chǎn)品,大連寶生生物工程公司；Pfu PCR MasterMix、核酸Maker和GoldView(GV),上?？魄缟锛夹g(shù)有限公司；細(xì)菌基因組快速抽提試劑盒、PCR引物,上海生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH scan40筆式pH計(jì),上海般特儀器制造公司；SynergyTMH1多功能酶標(biāo)儀,德國(guó)BioTek公司；DK-8D三孔三溫?cái)?shù)顯恒溫水浴鍋,常州申光儀器有限公司；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司；SBA-40X三通道生物傳感分析儀,濟(jì)南延和生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 醬油感官評(píng)價(jià)的測(cè)定

醬醪過(guò)濾所得原油經(jīng)巴氏殺菌后進(jìn)行感官鑒評(píng)。設(shè)置鮮味、咸味、酸味、苦味、甜味、氣味、色澤7個(gè)評(píng)價(jià)維度,組織20位有經(jīng)驗(yàn)鑒評(píng)人員進(jìn)行感官評(píng)分,滿分為10分,其中高鹽組(H)為對(duì)照,定為6分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為各指標(biāo)比對(duì)照濃/好打6～10分,比對(duì)照淡/差打1～6分,每項(xiàng)指標(biāo)的最終得分為20位鑒評(píng)人員所打分值的平均值。

1.3.2 微生物菌落總數(shù)的測(cè)定

將醬醪攪拌搖勻,并在超凈臺(tái)中取0.5～1 mL至15 mL離心管中,用無(wú)菌水將樣品稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4濃度梯度；將10-2、10-3、10-4濃度梯度的稀釋樣品吸取100 μL分別涂布于PDA、PCA、MRS平板,每個(gè)梯度3個(gè)平行；將接種后的MRS平板培養(yǎng)基倒置于30 ℃無(wú)氧環(huán)境中培養(yǎng),PDA和PCA培養(yǎng)基置于30 ℃環(huán)境中培養(yǎng)。

PCA培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)24 h左右計(jì)數(shù)其菌落總數(shù),PDA培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)2～3 d對(duì)酵母進(jìn)行計(jì)數(shù),MRS培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)2～3 d對(duì)乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。一般選取菌落數(shù)在30～300的稀釋梯度進(jìn)行計(jì)數(shù),3個(gè)平板分別計(jì)為N1、N2、N3。菌落總數(shù)計(jì)算如公式(1)所示：

菌落總數(shù)=10×(N1+N2+N3)/(3×D)

(1)

式中：D,計(jì)數(shù)的稀釋梯度。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

使用pH計(jì)直接測(cè)定醬醅樣本的pH值；乳酸采用三通道生物傳感分析儀測(cè)定；氨基酸態(tài)氮和總酸的測(cè)定參照GB 5009.40—2003 《醬衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；還原糖的含量測(cè)定(以葡萄糖計(jì))參考GB 5009.7—2016 《食品中還原糖的測(cè)定》；無(wú)鹽固形物含量測(cè)定參考GB/T 18186—2000 《釀造醬油》。

1.3.4 高通量微生物基因組測(cè)序

測(cè)序流程：細(xì)菌測(cè)序區(qū)域?yàn)?6S rRNA的V3～V4可變區(qū),所用通用引物為341F(5′-CCTA-CGGGNGGCWGCAG-3′)和908R(5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′)；真菌測(cè)序區(qū)域?yàn)?8S rRNA的ITS1可變區(qū),所用通用引物為ITS1F(5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4R(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)及擴(kuò)增產(chǎn)物提取也按照文獻(xiàn)的說(shuō)明進(jìn)行,提取獲得的擴(kuò)增子由北京百邁客生物科技有限公司應(yīng)用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件,經(jīng)堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(Sequenced Reads)進(jìn)行信息分析。

1.3.5 信息分析流程

首先使用Trimmomatic v0.33軟件[16],對(duì)測(cè)序得到的Raw Reads進(jìn)行過(guò)濾；然后使用cutadapt 1.9.1軟件[17]進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除,獲得Clean Reads。使用Usearch v10軟件[18],對(duì)Clean Reads進(jìn)行拼接,然后根據(jù)長(zhǎng)度范圍進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾。使用UCHIME v4.2軟件[19],鑒定并去除嵌合體序列,得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective Reads)。使用Usearch軟件對(duì)Reads在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類,細(xì)菌以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫(kù)[20],真菌則以UNITE為參考數(shù)據(jù)庫(kù)[21]使用樸素貝葉斯分類器結(jié)合比對(duì)的方法對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋；利用QIIME軟件[22]生成不同相對(duì)豐度、豐富度、多樣性指數(shù)和相異性矩陣。使用PAST軟件[23]及Excel進(jìn)行非度量多維尺度分析(nonmetric multidimensional scale analysis,NMDS)數(shù)據(jù)繪圖,使用SPSS 23進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程感官質(zhì)量分析

不同發(fā)酵鹽濃度醬油感官質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示(圖1),降低鹽水濃度對(duì)提升醬油的鮮味有明顯貢獻(xiàn),這可能與鹽濃度降低后,曲霉酶系活性更佳,產(chǎn)生了更多鮮味氨基酸所致。但同時(shí)產(chǎn)生了較明顯的酸味,醬油總體香氣水平也明顯下降,色澤明顯較淡,影響醬油感官品質(zhì),L組更為突出。

圖1 不同鹽濃度醬油的感官質(zhì)量評(píng)價(jià)Fig.1 Sensory evaluation of soy sauce with different salt concentration

2.2 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程微生物

不同鹽濃度發(fā)酵過(guò)程醬醪中微生物含量如表2。不同鹽分醬醪細(xì)菌含量在發(fā)酵初期并無(wú)顯著性差異(P<0.05),在發(fā)酵過(guò)程中均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。真菌及乳酸菌數(shù)量則呈現(xiàn)不同趨勢(shì),在發(fā)酵初期隨著鹽濃度的提高而降低,證明鹽濃度的提高對(duì)真菌及乳酸菌形成有效抑制。其中真菌總數(shù)在發(fā)酵中期各組別均有顯著的提升,但L組含量更高,數(shù)值達(dá)到6.46 lg CFU/mL,而M組和H組則分別為6.32和2.43 lg CFU/mL。在乳酸菌含量方面,L組在發(fā)酵初期與M組和H組的差異達(dá)到2個(gè)數(shù)量級(jí)；中期也呈現(xiàn)微量的提升但差異并不顯著(P<0.05),發(fā)酵后期時(shí)又有所降低,其中L組乳酸菌含量對(duì)數(shù)值從中期至后期由6.37降至4.60,而M組和H組雖有所減少,但并無(wú)顯著性差異,說(shuō)明鹽濃度對(duì)于微生物的影響貫穿于整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)。

表2 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程中各類微生物菌落總數(shù)Table 2 The total colonies forming unit in the fermentation process of sauce mash with different salt content

*注：L、M、H分別表示低鹽組(120 g/L)、中鹽組(150 g/L)和高鹽組(170 g/L)；I、II、III分別表示發(fā)酵第5天(I)、第25天(II)、第55天(III)；Turkey HSD多重比較檢驗(yàn)不同鹽分組間差異,同一列不同小寫字母標(biāo)記的數(shù)值表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程理化特性分析

總酸的高低直接影響醬油的滋味,對(duì)醬油的最終品質(zhì)有重要影響,而乳酸菌等微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸是醬油中總酸的重要來(lái)源。由3種不同鹽水濃度下生產(chǎn)醬油原油的總酸變化(表3)可知,發(fā)酵全程減鹽條件(L、M)總酸含量相比H組明顯提高,與文獻(xiàn)報(bào)道相似[24],對(duì)比表2微生物變化情況,L組和H組總酸含量較高可能是由于鹽分降低對(duì)產(chǎn)酸微生物(如乳酸菌)的抑制作用減弱所導(dǎo)致[25-26]。

氨基酸態(tài)氮的高低直接影響醬油的鮮味,是醬油國(guó)標(biāo)中(GB 18186—2000)衡量醬油等級(jí)的重要參數(shù),不同鹽分醬醪發(fā)酵原油氨基酸態(tài)氮含量(表3)都達(dá)到了特級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)(0.8 g/100 mL)。同一發(fā)酵時(shí)期,氨基酸態(tài)氮的含量與鹽濃度成反比(55 d最明顯),與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[26]。在發(fā)酵進(jìn)行的第55天,L組氨基態(tài)氮達(dá)到1.148 g/100 mL,比H組提高了49%。氨基酸是由微生物分泌的蛋白水解酶水解蛋白產(chǎn)生,高鹽條件對(duì)微生物的生長(zhǎng)及蛋白酶活力有一定抑制作用,而鹽分降低后微生物含量更為豐富,對(duì)蛋白酶活的抑制作用更低,最終導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量更高[25,27]。

表3 不同鹽分醬醪發(fā)酵過(guò)程中基本理化指標(biāo)含量Table 3 Physiochemical characteristics of soy sauce mash with different salt content

可溶性無(wú)鹽固形物是評(píng)價(jià)醬油好壞的一個(gè)重要指標(biāo),代表著發(fā)酵過(guò)程中原料物質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化產(chǎn)生各種小肽、氨基酸、還原糖類物質(zhì)的水平。由表3可知,3組醬油無(wú)鹽固形物的含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)相似,緩慢穩(wěn)定上升,但并無(wú)顯著性差異。還原糖是醬醪微生物代謝的物質(zhì)基礎(chǔ),L組發(fā)酵全程還原糖含量明顯較低,且下降迅速,25 d開始趨于平穩(wěn)且較低的水平,表明微生物代謝更為旺盛,尤其是酵母及乳酸菌含量更高(表2),造成還原糖被相對(duì)充分利用,但總體上差異并不顯著。

2.4 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程微生物組成及多樣性分析

采用二代測(cè)序?qū)?20、150、170 g/L鹽濃度發(fā)酵醬醪的不同階段進(jìn)行微生物多樣性分析,進(jìn)一步深入理解鹽度降低后微生物的組成變化情況。

2.4.1 不同鹽濃度醬醪中細(xì)菌群落分布分析

通過(guò)16S二代測(cè)序共獲得2 158 201對(duì)Reads,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生79 374條Clean Reads,平均產(chǎn)生79 703條Clean Reads,各樣品Q30都處于至少95%的水平,各樣品Goods Coverage的中位數(shù)均在0.99以上,意味著數(shù)據(jù)采集具有足夠的完整性及代表性。其中門及屬水平群落結(jié)構(gòu)分布隨鹽濃度和時(shí)間變化的結(jié)果分別如圖2-a所示,其中豐度最高前3的細(xì)菌門分別是厚壁菌門(Firmicutes,79.58%～94.19%)、變形菌(Proteobacteria,1.96%～6.50%)及擬桿菌門(Bacteroidetes,1.88%～5.83%)。

a-門水平；b-屬水平圖2 門水平和屬水平下不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure during the fermentation process of soy sauce mash with different salt concentrations at the phylum level and genus level

魏斯氏菌屬(Weissella)是醬醪樣品中最主要的細(xì)菌,占據(jù)54.69%～78.00%(圖2-b)。而葡萄球菌屬(Staphylococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和乳桿菌屬(Lactobacillus)的相對(duì)豐度分別介于1.38%～9.22%、2.41%～5.75%及1.92%～10.81%。

在醬醪樣品中前10個(gè)細(xì)菌屬中,乳酸菌就占了5個(gè),還包括了鏈球菌屬(Streptococcus,0.79%～2.83%)及乳球菌屬(Lactococcus)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、葡萄球菌屬等[28-30],與本研究結(jié)論一致。其中,魏斯氏菌屬是醬醪樣品中主要乳酸菌,豐度占比54%～78%,變化趨勢(shì)較為穩(wěn)定,在發(fā)酵全過(guò)程發(fā)揮重要作用。隨著鹽濃度降低,微生物菌群組成發(fā)生明顯變化,其中L組乳桿菌含量在25 d(II)后有明顯的增生,相對(duì)豐度超過(guò)10%；而葡萄球菌屬(Staphylococcus)及乳球菌屬(Lactococcus)均在L組中持續(xù)增長(zhǎng),在發(fā)酵L組55 d(III)其相對(duì)豐度明顯高于鹽分150 g/L(M)和170 g/L(H)的樣品。以上結(jié)果表明,醬醪發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌是主要的細(xì)菌,而鹽分降低會(huì)導(dǎo)致乳桿菌、葡萄球菌、乳球菌等相對(duì)豐度升高,從而影響乳酸菌組成。

2.4.2 不同鹽濃度醬醪中細(xì)菌α-生物多樣性分析

從圖3-a中可見,在57 130 reads的水平上,120 g/L(L)樣品在發(fā)酵5 d(I)、25 d(II)后,其系統(tǒng)發(fā)育多樣性均值是低于150 g/L(M)和170 g/L(H)鹽分的樣品,代表其菌群結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)發(fā)育樹上有著較為親密的關(guān)系。在observed species和Chao1指數(shù)分析中發(fā)現(xiàn)L組和M組醬醪在發(fā)酵初期(I)就有較高的微生物豐富度,并在發(fā)酵25 d(II)及55 d(III)后展示出比H組更高的細(xì)菌微生物物種豐富度及物種均勻度(香農(nóng)指數(shù))。說(shuō)明高鹽落黃發(fā)酵能夠有效防止非耐鹽細(xì)菌的生長(zhǎng)[5],并在25 d后才達(dá)到較高的微生物豐度。

a-PD整樹(PD whole tree)；b-觀察物種(Observed species)；c-物種豐富度(Chao1)；d-香濃指數(shù)(Shannon)圖3 基于57 130 reads水平不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程的細(xì)菌α-多樣性分析Fig.3 Bacterial α-diversity analysis based on 57 130 reads during the fermentation process of soy sauce mash with different salt concentrations

2.4.3 不同鹽濃度醬醪中細(xì)菌β-生物多樣性分析

通過(guò)不同β-生物多樣性距離矩陣與NMDS分析發(fā)現(xiàn)(圖4),即不同鹽份醬醪在初始階段(I,發(fā)酵5 d,紅色)雖然微生物物種及分布有所差異,但逐步在25 d發(fā)酵(II,綠色)后細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)形成了較為集中的族群,并在發(fā)酵55 d(III,黃色)后形成了更為明顯的族群。此外,β-生物多樣性也展示了不同鹽分醬醪在發(fā)酵過(guò)程中其細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)會(huì)往同個(gè)方向演變,形成了明顯的演變路線及規(guī)律,與之前的報(bào)道相符[31]。圖4-a及圖4-d中可知低鹽組(L,黃色正方形)與中鹽(M,黃色三角形)及高鹽組(H,黃色圓形)有相較明顯的區(qū)分,能夠形成單一族群的。雖然隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng),往同個(gè)方向演變,但低鹽組在發(fā)酵后期(III)明顯的脫離了中鹽及高鹽組的族群,微生物菌群上是有一定的差異。

a-加權(quán)UniFrac；b-未加權(quán)UniFrac；c-Euclidean；d-Bray-Curtis圖4 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程的細(xì)菌β-生物多樣性距離矩陣與NMDS分析Fig.4 Bacterial β-diversity distance matrix and NMDS analysis during the fermentation of sauce mash with different salt concentrations

2.4.4 不同鹽濃度醬醪中真菌群落分布分析

通過(guò)ITS全長(zhǎng)二代測(cè)序后通過(guò)Barcode識(shí)別后共獲得2 074 495對(duì)Reads。每個(gè)樣品至少產(chǎn)生47 220條Clean Reads,平均產(chǎn)生76 618條Clean Reads,各樣品Q30都處于至95%的水平,Goods Coverage的中位數(shù)均在0.99以上,意味著數(shù)據(jù)采集具有足夠的完整性及代表性。其中門水平群落結(jié)構(gòu)分布隨鹽濃度和時(shí)間變化的結(jié)果分別如圖5-a所示,其中豐度最高前3的細(xì)菌門分別是子囊菌門(Ascomycota,94.27%～99.57%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota,0.31%～3.99%)及被孢霉菌門(Mortierellomycota,0.05%～1.36%)。

a-門水平；b-屬水平圖5 門水平和屬水平下不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程真菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.5 Fungi community structure during the fermentation process of soy sauce mash with different salt concentrations at the phylum level and genus level

屬水平群落結(jié)構(gòu)如圖5-b所示。醬油發(fā)酵醬醪中相對(duì)含量最為豐富的是曲霉菌屬(Aspergillus,81.79%～97.01%)、假絲酵母菌屬(Candida,0.43%～4.14%)、米勒氏酵母屬(Millerozyma,0～8.60%)、鐮刀菌屬(Fusarium,0.10%～1.82%)、被孢霉屬(Mortierella,0.05%～1.32%)、維希尼克氏酵母屬(Vishniacozyma,0.21%)、粗糙孔菌屬(Trechispora,0～1.62%)、鏈格孢屬(Alternaria,0.04%～0.47%)、枝孢屬(Cladosporium,0.06%～0.41%)。

醬醪中的曲霉是制曲期間人工引入的,是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌種,與文獻(xiàn)報(bào)道相符[28]。除此之外酵母是主要的微生物。如圖5-a,M組和H組的真菌菌群組成相似,與L組差異明顯,其中假絲酵母屬(Candida)和米勒氏酵母屬(Millerozyma)含量在L組醬醪中顯著提高。已有研究表明,在醬油釀造過(guò)程中,假絲酵母(Candidaspp.)從開始的0.03%隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)逐漸增加[30]。此外,有文獻(xiàn)報(bào)道Millerozyma菌屬在發(fā)酵中期出現(xiàn)并持續(xù)增長(zhǎng)[29,31]。

2.4.5 不同鹽濃度醬醪中真菌α-生物多樣性分析

從圖6中可見,L組樣品在發(fā)酵5 d(I)、25 d(II)后,其系統(tǒng)發(fā)育多樣性均值低于150 g/L(M)和170 g/L(H)鹽分的樣品,代表著菌群結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)發(fā)育樹上有著較為親密的關(guān)系。在observed species及Chao1分析中發(fā)現(xiàn)L組中在發(fā)酵初期(發(fā)酵5 d,I；發(fā)酵25 d,II)物種豐富度相比M組和H組醬醪較低。隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng),各鹽分濃度醬醪細(xì)菌組成逐步演變,物種豐富度和均勻度逐步增加(香農(nóng)指數(shù))。

a-PD整樹(PD whole tree)；b-觀察物種(Observed species)；c-物種豐富度(Chao1)；d-香農(nóng)指數(shù)(Shannon)圖6 基于62 450 reads水平不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程的真菌α-多樣性分析Fig.6 Fungi α-diversity analysis based on 62 450 reads during the fermentation process of soy sauce mash with different salt concentrations

2.4.6 不同鹽濃度醬醪中真菌β-生物多樣性分析

在β-生物多樣性方面,真菌保持著與細(xì)菌β-生物多樣性相似的演變規(guī)律。圖7表中通過(guò)Euclidean及Bray-Curtis差異矩陣算法得到了相同的趨勢(shì),即不同鹽分醬醪在初始階段(I,發(fā)酵5 d,紅色)和25 d發(fā)酵(II,綠色)無(wú)法形成顯著的差異,則在發(fā)酵55 d(III,黃色)后才形成了較明顯的族群。

2.5 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程中微生物相對(duì)濃度與理化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)

對(duì)總酸、pH值及細(xì)菌真菌豐度最高的3個(gè)菌科進(jìn)行相關(guān)性分析。圖8-a表明,發(fā)酵全程減鹽條件(L、M)總酸含量相比高鹽組(H)明顯提高,L組總酸最高,pH值最低。L組醬醪中酵母菌目(Debaryo-mecetaceae)的含量在發(fā)酵初期就形成優(yōu)勢(shì)菌群并隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增長(zhǎng),在中期(發(fā)酵25 d,II)形成了顯著的含量差異,并在發(fā)酵55 d(III)時(shí),與M組和H組相對(duì)含量差異超過(guò)11%。而在科水平上,L組和M組在發(fā)酵前期(發(fā)酵第5天,I),細(xì)菌明串珠菌科(Leuconostocaceae)及乳桿菌科(Lactobacillaceae)的相對(duì)含量比H組更高,這可能是導(dǎo)致L組和M組總酸更高的原因。

a-Euclidean；b-Bray-Curtis圖7 不同鹽濃度醬醪發(fā)酵過(guò)程的真菌β-生物多樣性距離矩陣與NMDS分析Fig.7 Fungi β-biodiversity distance matrix and NMDS analysis during the fermentation of sauce mash with different salt concentrations

結(jié)合L組展現(xiàn)較高的細(xì)菌α-多樣性指數(shù)及較高的明串珠菌科(Leuconostocaceae)及乳桿菌科(Lactobacillaceae)相對(duì)含量可知,減鹽醬醪由于較低的滲透壓,無(wú)法對(duì)細(xì)菌,尤其是乳酸菌形成足夠的壓制,導(dǎo)致發(fā)酵前期總酸快速提升,pH值快速降低[24-25]。而這同時(shí)也為酵母菌快速形成了良好的生長(zhǎng)環(huán)境[10-11],并在發(fā)酵中期(25 d)形成了明顯的低真菌α-多樣性的菌群結(jié)構(gòu)(圖6),對(duì)應(yīng)為更高的假絲酵母屬(Candida)和米勒氏酵母屬(Millerozyma)含量(圖5)。

a-總酸與pH值；b-總酸與酵母菌目；c-總酸與明串珠菌科；d-總酸與乳桿菌科圖8 不同鹽分及發(fā)酵周期中總酸、pH值及總酸與微生物的含量變化Fig.8 Changes in total acid,pH and microbial relative abundance during the fermentation of sauce mash with different salt concentrations

3 結(jié)論

本研究基于微生物計(jì)數(shù)、理化指標(biāo)及高通量基因序列分析發(fā)現(xiàn)低鹽分醬醪體系中乳酸菌和真菌的總量更高,原油pH值更低,發(fā)酵后快速積累總酸、氨基酸態(tài)氮,消耗還原糖,同時(shí)乳桿菌(Lactobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)及乳球菌屬(Lactococcus)含量在L組有明顯的增生,擁有較高的α生物多樣性。此外,假絲酵母屬(Candida)和米勒氏酵母屬(Millerozyma)含量在L組醬醪中明顯較高,但真菌α多樣性較M組和H組低。L組在發(fā)酵初期含有較高的乳酸菌含量,并快速形成了更加適合酵母菌目生長(zhǎng)的酸性環(huán)境,導(dǎo)致酵母菌目在發(fā)酵中期形成了明顯的優(yōu)勢(shì)菌群。該研究結(jié)果揭示了減鹽發(fā)酵條件下醬油發(fā)酵微生物菌群結(jié)構(gòu)演變規(guī)律,可為高鹽稀態(tài)醬油減鹽發(fā)酵過(guò)程中的微生物調(diào)控提供參考依據(jù)。