金賽,孫福新,胡志杰,李由然,堵國(guó)成,石貴陽(yáng)*,陳堅(jiān)*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司,江蘇 無(wú)錫,214122)

檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝物,廣泛存在于自然界中,是一種重要的有機(jī)酸[1],天然無(wú)害,無(wú)色無(wú)臭,具有令人愉悅的酸味,在食品工業(yè)中作為酸味劑被廣泛應(yīng)用[2]。檸檬酸具有中強(qiáng)酸性,且擁有3個(gè)羧基等獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性,廣泛用于化學(xué)工業(yè),被認(rèn)為是重要的六碳平臺(tái)化合物[3]。此外,檸檬酸的應(yīng)用范圍拓展至醫(yī)藥[4]、交聯(lián)劑[5-7]、土壤修復(fù)[8-10]等新領(lǐng)域,需求量逐年上升。

當(dāng)前,檸檬酸主要通過(guò)黑曲霉(Aspergillusniger)發(fā)酵獲得：先制備黑曲霉孢子,然后接入種子罐培養(yǎng),種子成熟后再移入發(fā)酵罐中發(fā)酵,最后提取得到檸檬酸產(chǎn)品[11-13]。在當(dāng)前的種子培養(yǎng)中,孢子先要經(jīng)過(guò)激活,然后才膨脹發(fā)芽,并開(kāi)始菌絲生長(zhǎng)。孢子萌發(fā)通常超過(guò)8 h,增加了種子培養(yǎng)周期,降低了生產(chǎn)效率[14]。并且,種子培養(yǎng)無(wú)法同時(shí)匹配孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)最適條件,導(dǎo)致孢子發(fā)芽率低、菌絲活力差。另外,孢子間存在吸附作用,容易聚集成團(tuán)[15],多個(gè)凝聚的孢子只能形成一個(gè)菌絲球,降低了成球率；且形成的菌絲球大小不一,部分菌絲球直徑較大,中心形成致密區(qū),無(wú)法與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣有效接觸,導(dǎo)致菌體轉(zhuǎn)化效率降低[16]。因此,如何改進(jìn)黑曲霉種子培養(yǎng)方法,提高種子培養(yǎng)效率和改善菌絲球形態(tài)是檸檬酸生產(chǎn)中亟待解決的重要課題。

本研究提出了孢子預(yù)培養(yǎng)策略,即先激活孢子、促進(jìn)發(fā)芽,再利用發(fā)芽孢子進(jìn)行種子培養(yǎng)。孢子萌發(fā)是絲狀真菌對(duì)環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答并開(kāi)始生長(zhǎng)的關(guān)鍵點(diǎn),但關(guān)于工業(yè)化黑曲霉孢子萌發(fā)的研究報(bào)道較少，并且發(fā)芽孢子替代休眠孢子接種對(duì)于菌絲球形態(tài)的影響未見(jiàn)報(bào)道。基于此,本研究對(duì)孢子萌發(fā)的條件進(jìn)行考察,研究顆粒物添加和振蕩分散對(duì)發(fā)芽孢子、菌絲球形態(tài)以及發(fā)酵結(jié)果的影響；最后,在5 000 L規(guī)模進(jìn)行工藝放大驗(yàn)證，以期有效提升檸檬酸生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

黑曲霉,江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司。

1.1.2 材料

玉米粉,市售玉米粉碎后過(guò)60目篩；α-高溫淀粉酶,諾維信(中國(guó))公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)。

液化液制備：將玉米粉和60 ℃去離子水按照質(zhì)量比1∶3.2混合,用Ca(OH)2調(diào)pH至5.8～6.0,按照25 U/g玉米粉的比例加入α-高溫淀粉酶,然后用中試液化系統(tǒng)加熱至97 ℃維持2 h得到液化液。70%的液化液經(jīng)過(guò)板框壓濾機(jī)過(guò)濾得到糖液和玉米渣。未過(guò)濾的液化液和過(guò)濾后的糖液用來(lái)配制培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：由液化液和硫酸銨配制而成,初始總糖質(zhì)量濃度為100 g/L,總氮質(zhì)量濃度為2 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：由玉米液化液和糖液配制而成,初始總糖質(zhì)量濃度為140～170 g/L,總氮質(zhì)量濃度為8.5～10.5 g/L。

1.1.4 儀器與設(shè)備

HYW中試液化系統(tǒng),上海兆光生物工程設(shè)計(jì)研究院；XA/MY12板框壓濾機(jī),浙江金鳥(niǎo)公司；YM75立式高壓滅菌鍋,上海三申醫(yī)療器械有限公司；DHZ-LA振蕩搖床,太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DFC450光學(xué)顯微鏡、DM1000顯微照相機(jī),德國(guó)Leica公司；發(fā)酵罐(30、500、5 000 L),無(wú)錫匯森生物設(shè)備有限公司；UDK159凱氏定氮儀,意大利Velp公司；Waters 1525高效液相色譜儀,美國(guó)Waters有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉孢子制備

將菌種接種至試管斜面,35 ℃培養(yǎng)5～7 d,待孢子成熟后用接種環(huán)轉(zhuǎn)接至茄形瓶中,35 ℃培養(yǎng)6～8 d獲得成熟的黑曲霉孢子。

1.2.2 孢子預(yù)培養(yǎng)

在三角瓶中進(jìn)行孢子預(yù)培養(yǎng)。裝液量為50 mL/250 mL。以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別考察碳源(葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉)、氮源(硫酸銨、玉米漿和酵母膏)、Ca2+濃度(0、0.1、1、10、100 mmol/L)、pH(3、4、5、6、7、8)、溫度(25、30、35、40 ℃)、轉(zhuǎn)速(0、50、100、200 r/min)、孢子濃度(2.4×108、1.6×108、0.8×108、0.08×108、0.008×108CFU/mL)和培養(yǎng)時(shí)間的影響。

1.2.3 菌絲球形態(tài)控制

在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加2 g/L玉米渣,考察顆粒物對(duì)發(fā)芽孢子凝聚的影響。將種子培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)8層紗布過(guò)濾除去玉米渣,考察對(duì)菌絲球形態(tài)的影響,并統(tǒng)計(jì)成球率。聚團(tuán)的發(fā)芽孢子,經(jīng)過(guò)振蕩處理,使孢子分散,再轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),觀察菌絲球形態(tài),并統(tǒng)計(jì)成球率。搖瓶種子培養(yǎng)條件：裝液量為50 mL/250 mL,孢子終濃度為3×105CFU/mL,培養(yǎng)溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為300 r/min。

1.2.4 菌絲球形態(tài)對(duì)發(fā)酵的影響

將1.2.3部分培養(yǎng)得到不同形態(tài)的菌絲球按10%(體積分?jǐn)?shù))的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖床培養(yǎng),培養(yǎng)條件同上。

1.2.5 放大驗(yàn)證

對(duì)照組中,休眠孢子接入500 L罐進(jìn)行培養(yǎng)(裝液量為400 L,孢子終濃度為3×105CFU/mL,通風(fēng)比例0.8 vvm,罐壓0.07～0.08 MPa,溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速300 r/min),種子培養(yǎng)成熟后按照10%(體積分?jǐn)?shù))比例移入5 000 L罐進(jìn)行發(fā)酵(裝液量為4 000 L,通風(fēng)比例0.5 vvm,罐壓0.07～0.08 MPa,溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min),殘還原糖質(zhì)量濃度低于0.5 g/L停止發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)組中先將休眠孢子接入30 L罐內(nèi)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),孢子萌發(fā)后轉(zhuǎn)至500 L罐進(jìn)行培養(yǎng),種子成熟后移入5 000 L罐進(jìn)行發(fā)酵(與對(duì)照相同)。

1.2.6 孢子萌發(fā)及菌絲球形態(tài)分析

孢子計(jì)數(shù)：樣品經(jīng)過(guò)振蕩處理,將孢子分散均勻,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),有芽管的計(jì)為發(fā)芽孢子,每個(gè)樣品重復(fù)3次。菌絲球計(jì)數(shù)：用生理鹽水(0.9% NaCl,質(zhì)量分?jǐn)?shù))稀釋樣品,使菌絲球濃度達(dá)到102～103CFU/mL,在顯微鏡下計(jì)數(shù),每個(gè)樣品重復(fù)3次。發(fā)芽孢子和菌絲球用裝有顯微照相機(jī)的光學(xué)顯微鏡拍照。利用配套的萊卡應(yīng)用軟件(V4 Leica microsystems)對(duì)孢子直徑、菌絲長(zhǎng)度和菌絲球的直徑進(jìn)行顯微測(cè)量,每個(gè)樣品隨機(jī)選擇30個(gè)樣本,并求平均數(shù)。出芽率和成球率按公式(1)(2)計(jì)算:

(1)

(2)

1.2.7 檢測(cè)方法

發(fā)酵液采用布氏漏斗過(guò)濾,得到菌絲球和濾液。菌絲球用蒸餾水沖洗2遍后105 ℃烘至恒重,稱量得到菌絲體干重。殘總糖和殘還原糖：用斐林滴定法測(cè)定,測(cè)定殘總糖時(shí)先將濾液用硫酸完全水解。檸檬酸：濾液先用0.22 μm微孔濾膜再次過(guò)濾,然后進(jìn)行高效液相檢測(cè)。檢測(cè)條件：流動(dòng)相為0.005 moL/L H2SO4,流速為0.6 mL/min,柱溫為35 ℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm,進(jìn)樣量為10 μL?？偟簶悠废冗M(jìn)行消化,然后采用凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)均為3組以上平行,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,2組數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析；3組以上數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行兩兩比較分析,顯著性水平均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響

圖1-a顯示,淀粉對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)幾乎沒(méi)有促進(jìn)作用,各參數(shù)與對(duì)照接近；蔗糖能促進(jìn)孢子萌發(fā),發(fā)芽率高于對(duì)照；葡萄糖能顯著促進(jìn)孢子萌發(fā)(P<0.05),孢子發(fā)芽率和芽管長(zhǎng)度均最高。孢子從休眠到萌發(fā),需要外源物質(zhì)激活,相比于蔗糖和淀粉,葡萄糖更有利于吸收利用,從而促進(jìn)孢子萌發(fā)。氮源對(duì)孢子萌發(fā)具有促進(jìn)作用,但與無(wú)機(jī)氮源相比,營(yíng)養(yǎng)豐富的有機(jī)氮源對(duì)孢子萌發(fā)影響更顯著(P<0.05),添加玉米漿時(shí),發(fā)芽率和芽管長(zhǎng)度均最高(圖1-b)。圖1-c顯示,Ca2+濃度在0～10 mmol/L,發(fā)芽率和芽管長(zhǎng)度隨著Ca2+濃度增加而逐漸升高。Ca2+在細(xì)胞膜運(yùn)輸中起到重要作用[17],能幫助輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),能促進(jìn)孢子萌發(fā)。然而,當(dāng)Ca2+濃度增加至100 mmol/L時(shí),孢子萌發(fā)被抑制,發(fā)芽率和芽管長(zhǎng)度均降低。因此,后續(xù)試驗(yàn)中Ca2+濃度確定為10 mmol/L。圖1-d顯示,黑曲霉孢子對(duì)pH的適應(yīng)性較寬,在pH 3～8內(nèi)均可以萌發(fā),最適的pH為5～7。pH過(guò)高或過(guò)低均不利于芽管生長(zhǎng),pH為5時(shí)芽管長(zhǎng)度最高,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇預(yù)培養(yǎng)pH為5。圖1-e顯示,溫度為25 ℃時(shí)黑曲霉孢子萌發(fā)較慢；溫度達(dá)到40 ℃時(shí),孢子停止萌發(fā),處于休眠狀態(tài)；預(yù)培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí),孢子發(fā)芽率和芽管長(zhǎng)度均最高。圖1-f顯示,靜置培養(yǎng)時(shí),孢子發(fā)芽率較低,大部分孢子仍處于休眠狀態(tài)；而在50～150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)時(shí),孢子發(fā)芽率均較高,且孢子萌發(fā)情況相差不大,說(shuō)明孢子萌發(fā)需要供應(yīng)少量氧氣。圖1-g顯示,孢子濃度>0.8×108CFU/mL時(shí),發(fā)芽率幾乎為0；而孢子濃度<0.8×108CFU/mL時(shí),發(fā)芽率和芽管長(zhǎng)度均隨著孢子濃度降低而升高。結(jié)果說(shuō)明,低濃度孢子有利于萌發(fā),濃度過(guò)高會(huì)抑制孢子萌發(fā)。圖1-h顯示,隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),發(fā)芽率和芽管長(zhǎng)度逐漸增加。培養(yǎng)10 h后,發(fā)芽率幾乎沒(méi)有升高,但芽管長(zhǎng)度仍繼續(xù)增加,說(shuō)明孢子已經(jīng)完成發(fā)芽進(jìn)入菌絲生長(zhǎng)階段。

a-碳源種類；b-氮源種類；c-Ca2+濃度；d-pH；e-溫度；f-搖床轉(zhuǎn)速；g-孢子濃度；h-時(shí)間圖1 預(yù)培養(yǎng)條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of pre-culture conditions on spore germination

2.2 菌絲球形態(tài)的控制

在孢子預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中,孢子容易凝聚成團(tuán),形成較大的菌絲球。為控制孢子形成均勻的小菌絲球,考察了顆粒物和振蕩分散處理等方式對(duì)孢子凝聚和菌絲球形態(tài)的影響,結(jié)果如圖2所示。休眠孢子直接進(jìn)行種子培養(yǎng)時(shí),顆粒物對(duì)菌絲球形態(tài)影響顯著(圖2-A1和圖2-A2,P<0.05)。孢子預(yù)培養(yǎng)中,添加顆粒物時(shí),形成分散的發(fā)芽孢子；而不含顆粒物時(shí),形成聚團(tuán)的發(fā)芽孢子。結(jié)果表明,孢子萌發(fā)前添加顆粒物,對(duì)發(fā)芽孢子的凝聚影響明顯。同時(shí),無(wú)論種子培養(yǎng)基是否含有顆粒物,分散的發(fā)芽孢子均能形成大量的小菌絲球(圖2-B1和圖2-B2)；而聚團(tuán)的發(fā)芽孢子均形成少量的大菌絲球(圖2-C1和圖2-C2)。結(jié)果表明,在孢子發(fā)芽后,顆粒物對(duì)菌絲球形態(tài)的影響較小,并且菌絲球形態(tài)主要取決于發(fā)芽孢子是否凝聚。另外,將聚團(tuán)發(fā)芽孢子分散后再進(jìn)行種子培養(yǎng),也能形成大量的小菌絲球(圖2-D1和圖2-D2)。進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)芽孢子是否聚團(tuán)對(duì)菌絲球形態(tài)起決定性作用。因此,孢子萌發(fā)前添加顆粒物和孢子聚團(tuán)后振蕩分散可以控制最終菌絲球形態(tài)。DRIOUCH等[18-20]認(rèn)為發(fā)酵液添加微粒子可以通過(guò)碰撞干擾孢子間的相互作用,阻礙孢子凝集,防止后期形成較大團(tuán)塊。他研究發(fā)現(xiàn)添加硅酸鹽、滑石粉和氧化鋁等顆粒物,黑曲霉形態(tài)有較大改觀,菌絲球直徑減小。本研究通過(guò)添加有機(jī)物顆粒,補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)源的同時(shí)也控制了菌絲球形態(tài),對(duì)菌體的資源化利用不產(chǎn)生影響,實(shí)用價(jià)值更強(qiáng)。

N-菌絲球濃度；Rp-成球率圖2 菌絲球形態(tài)的控制Fig.2 The control of mycelial morphology

2.3 菌絲球形態(tài)對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響

菌絲球形態(tài)對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響如表1所示。無(wú)論是采用休眠孢子接種,還是采用發(fā)芽孢子接種,或是將聚團(tuán)的發(fā)芽孢子進(jìn)行分散處理后接種,所有的結(jié)果均顯示,菌絲球大小對(duì)發(fā)酵結(jié)果具有顯著性影響,小菌絲球?qū)?yīng)的發(fā)酵強(qiáng)度和單位細(xì)胞產(chǎn)酸速率均顯著高于大菌絲球?qū)?yīng)的發(fā)酵結(jié)果(P<0.05)。

大量文獻(xiàn)顯示了相同的規(guī)律。ZHOU等[21]利用培養(yǎng)基和溫度控制戴爾根霉(Rhizopusdelemar)菌體形態(tài)產(chǎn)富馬酸,隨著球團(tuán)直徑的減小,干細(xì)胞質(zhì)量和富馬酸產(chǎn)量有增加的趨勢(shì)。WANG等[22]利用菌絲球分散策略分割發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸,相比菌絲球發(fā)酵,菌絲球分散后對(duì)應(yīng)的檸檬酸產(chǎn)量更高。

表1 菌絲球形態(tài)對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響Table 1 Effect of mycelium morphology on citric acid fermentation

2.4 放大驗(yàn)證

在優(yōu)化的條件下進(jìn)行放大驗(yàn)證,結(jié)果如圖3所示。種子培養(yǎng)時(shí),對(duì)照組總糖8 h后開(kāi)始消耗(圖3-a)；酸度和菌絲球直徑也相應(yīng)從8 h開(kāi)始增加(圖3-b和3-c),原工藝存在約8 h的延滯期。而實(shí)驗(yàn)組菌體快速進(jìn)入生長(zhǎng)階段,幾乎沒(méi)有延滯期(圖3-d),節(jié)省了孢子萌發(fā)時(shí)間,周期縮短12 h以上,提高了種子培養(yǎng)效率。雖然實(shí)驗(yàn)組需要10 h用于孢子預(yù)培養(yǎng),但是預(yù)培養(yǎng)具有孢子濃度高、體積小、氧氣和營(yíng)養(yǎng)消耗少等特點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)大批量集中培養(yǎng)。同時(shí),比較發(fā)酵過(guò)程曲線顯示,實(shí)驗(yàn)組糖消耗速度和產(chǎn)酸速度較快(圖3-e和3-f)；菌絲球直徑偏小(圖3-g),產(chǎn)酸速率較快(圖3-h),優(yōu)勢(shì)較明顯。

a-種子總糖；b-種子酸度；c-種子菌球直徑；d-種子菌體生長(zhǎng)速率；e-發(fā)酵總糖；f-發(fā)酵酸度；g-發(fā)酵菌球直徑；h-發(fā)酵產(chǎn)酸速率圖3 孢子預(yù)培養(yǎng)工藝放大驗(yàn)證Fig.3 Scale-up verification of spore pre-culture process

發(fā)酵結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)組提高了孢子分散性,菌絲球濃度和成球率增加非常顯著(P<0.01),分別增加了0.4×104CFU/mL和18.3%；菌絲球平均直徑下降了28 μm,變化顯著(P<0.05)。數(shù)量更多的小菌絲球更有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)化,最大產(chǎn)酸速率提高了7.5%,發(fā)酵強(qiáng)度提高顯著(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵周期縮短2 h。最終檸檬酸濃度和糖酸轉(zhuǎn)化率分別增加了2 g/L和1.2%。

表2 工藝放大驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Results of process amplification verification

3 結(jié)論

本研究針對(duì)現(xiàn)有檸檬酸生產(chǎn)種子延滯期長(zhǎng),發(fā)酵水平波動(dòng)大的問(wèn)題,提出孢子預(yù)培養(yǎng)和菌絲形態(tài)控制策略。研究獲得了孢子最佳萌發(fā)條件,并發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)前添加顆粒物和孢子聚團(tuán)后振蕩分散可以控制最終菌絲球形態(tài),發(fā)芽孢子是否凝聚對(duì)最終菌絲球形態(tài)起決定性作用。另外,小菌絲球?qū)е掳l(fā)酵產(chǎn)酸速率顯著提高。在中試規(guī)模工藝放大中,種子培養(yǎng)周期縮短12 h以上；成球率增加了18.3%,最大產(chǎn)酸速率提高了7.5%,發(fā)酵強(qiáng)度增加0.14 g/(L·h),發(fā)酵效率顯著提升。本研究對(duì)絲狀真菌孢子萌發(fā)、形態(tài)控制和生產(chǎn)效率的提升具有重要參考意義。