韓 娜，張彥彥，張中冕，張 芳，張 相，趙文超

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450014；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系，河南 鄭州 450001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別排在第2位和第5位［1］。大部分CRC患者確診時已經(jīng)處于局部進(jìn)展期，造成了CRC患者的預(yù)后較差，5 a生存率較低［2-3］。因此，尋找有效的生物預(yù)測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)對于CRC的防治具有重要的意義。CRC分為結(jié)腸癌和直腸癌，其中95%以上的結(jié)腸癌屬于結(jié)腸腺癌(colonic adenocarcinoma，COAD)。Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶α亞單位1(ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 1，ATP1A1)是Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶的主要成分之一［4］。研究［5-7］表明，ATP1A1在多種腫瘤中的表達(dá)發(fā)生了改變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。但是，ATP1A1在COAD組織中的表達(dá)及其作用并不清楚。本研究采用實時熒光定量PCR檢測了ATP1A1在COAD組織中的表達(dá)，并分析了ATP1A1的表達(dá)與COAD患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇2012年11月至2014年12月期間于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的患者作為納入對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：1) 原發(fā)腫瘤；2) 符合COAD在WHO中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；3) 臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1) 既往有惡性腫瘤病史；2) 術(shù)前行放、化療；3) 合并其他惡性腫瘤或林奇綜合征。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，共納入166例COAD患者。手術(shù)切除后的COAD組織以及配對的癌旁組織標(biāo)本(距離腫瘤邊緣≥3 cm)保存于-80 ℃低溫冰箱中。男103例，女63例；年齡19～87歲，中位年齡63.0歲，其中≤65歲85例，>65歲81例。腫瘤分級、TNM分期按照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會2017年第8版CRC分期標(biāo)準(zhǔn)：高中分化99例，低分化67例；T1+T2期34例，T3+T4期132例；N0期84例，N1+N2期82例。電話隨訪截至2019年1月1日。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審查后批準(zhǔn)，所有患者或家屬均簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑Trizol Reagent購自美國Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit購自日本Takara公司，F(xiàn)astStart ESSENTIAL DNA GREEN MASTER購自瑞士Roche公司，上、下游引物由中國生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄將COAD組織樣本研磨成粉后加入Trizol裂解，加入氯仿沉淀蛋白后離心取上清，加入異丙醇沉淀RNA，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌并離心沉淀RNA 2次，無酶水溶解RNA沉淀后測定濃度，按照說明書采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。

1.4 實時熒光定量PCR配制20 μL反應(yīng)體系：10 μL熒光染料(FastStart ESSENTIAL DNA GREEN MASTER)，上下游引物各4 μL(終濃度均為0.4 μmol/L)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.4 μL，無酶水1.6 μL。反應(yīng)過程如下：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)源參照，計算2-△△CT作為基因的表達(dá)水平。ATP1A1引物序列如下：上游：5’-ACAGACTTGAGCCGGGGATTA-3’，下游：5’-TCCATTCAGGAGTAGTGGGAG-3’。GAPDH引物序列如下：上游：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

2 結(jié)果

2.1 ATP1A1在COAD組織和配對的癌旁組織中表達(dá)的比較與癌旁組織(5.70±5.87)相比，ATP1A1在COAD組織中的表達(dá)顯著降低(2.96±3.98，t=4.966，P<0.001)。

2.2 ATP1A1的表達(dá)與COAD臨床病理特征的關(guān)系以0.945 543為界值，將166例COAD患者分為ATP1A1低表達(dá)組(≤0.945 543)和ATP1A1高表達(dá)組(>0.945 543)。COAD組織中ATP1A1的表達(dá)與腫瘤大小(χ2=5.537，P=0.019)、浸潤深度(χ2=5.326，P=0.021)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=5.103，P=0.024)。見表1。

2.3 ATP1A1的表達(dá)與COAD患者生存的關(guān)系A(chǔ)TP1A1低表達(dá)組COAD患者的中位生存時間[42.062(95%CI：37.355～46.770)個月]顯著低于ATP1A1高表達(dá)組COAD患者[52.099(95%CI：48.729～55.470)個月，χ2=9.954，P=0.002]。見圖1。

2.4 ATP1A1是COAD的獨(dú)立預(yù)后因素單因素COX回歸模型分析顯示，年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、病理分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ATP1A1表達(dá)均是COAD患者的預(yù)后因素。多因素COX回歸模型分析表明，腫瘤位置、病理分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ATP1A1表達(dá)是COAD患者的獨(dú)立預(yù)后因素，其中低表達(dá)ATP1A1預(yù)示著COAD患者的較差預(yù)后。見表2、3。

表3 多因素COX回歸模型分析結(jié)果

3 討論

Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶又叫做鈉泵，廣泛存在于機(jī)體的細(xì)胞膜上，具有分解ATP進(jìn)而主動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和K+的功能。鈉泵由α亞基、β亞基以及FXYD蛋白組成，其中α亞基分為4種亞型，即α1、α2、α3和α4，α1亞基也就是ATP1A1，在真核細(xì)胞中的表達(dá)最為廣泛［8-9］。研究［9-11］表明，ATP1A1參與了多條依賴于酪氨酸激酶的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終影響了細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。在腫瘤中的研究［9,12-17］發(fā)現(xiàn)，ATP1A1在食管鱗癌、肝癌、肺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)增加，在腎癌中的表達(dá)降低，促進(jìn)了相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但是，ATP1A1在COAD組織中的表達(dá)及其作用并不清楚。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，ATP1A1在COAD癌組織中的表達(dá)顯著降低，表明ATP1A1在COAD的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用，同ATP1A1在腎癌中的作用相似［17］。臨床病理特征相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)ATP1A1的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。這一結(jié)果表明，ATP1A1的表達(dá)降低可能具有促進(jìn)腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。在腎癌的研究［17］表明，ATP1A1可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，與本研究的結(jié)果相一致。但是，在食管鱗癌、肝癌、肺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究［9,12-16］中發(fā)現(xiàn)，ATP1A1在腫瘤組織中的表達(dá)增加，并且ATP1A1可以促進(jìn)相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，與本研究的結(jié)果完全相反。這種不一致性可能與腫瘤的組織特異性有關(guān)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，ATP1A1低表達(dá)COAD患者的生存時間較短，ATP1A1是COAD患者的獨(dú)立預(yù)后因素，表明ATP1A1可能是COAD患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，ATP1A1在COAD組織中的表達(dá)降低，可能具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用，從而參與了COAD的發(fā)生、發(fā)展，縮短了患者的生存時間。因此，ATP1A1不僅是影響COAD患者預(yù)后的可能獨(dú)立因素，也有望成為治療COAD的潛在靶點(diǎn)。