張偉杰，張鐘月，婁世同，李冬薈，王留興

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

三陰性乳腺癌多呈浸潤性生長，惡性程度偏高，易復(fù)發(fā)和多器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后較其他分子分型差，目前國內(nèi)外對三陰性乳腺癌的治療手段缺乏突破性研究進展［1-2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)早幼粒細胞白血病基因(promyelocytic leukemia protein，PML)在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織及正常乳腺組織，并且與分化程度和分期有關(guān)，PML在分化程度低、分期晚的組織中呈高表達，其中三陰性乳腺癌組織PML陽性表達率最高［3］。這些結(jié)果都提示PML參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)是中國傳統(tǒng)中藥，20世紀70年代，我國學(xué)者將As2O3應(yīng)用于治療急性早幼粒細胞性白血病取得顯著療效［4］。Chen等［5］報道As2O3治療急性早幼粒細胞白血病的療效是通過PML分子靶向白血病干細胞而實現(xiàn)的。PML分子有潛在抗腫瘤能力，PML可以將腫瘤抑制蛋白組構(gòu)成一個網(wǎng)絡(luò)來抑制腫瘤細胞的表達，或抑制腫瘤細胞增殖所需的其他蛋白質(zhì)的數(shù)量，這些蛋白質(zhì)在體內(nèi)是最基本的分子，發(fā)揮著控制細胞誕生、生長、死亡的作用［6-7］。最近有研究［8］證實，人肝癌細胞HuH7表達PML蛋白，發(fā)現(xiàn)As2O3可以刺激HuH7細胞及CD13+CD133+LCSCs的增殖，病誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與PML蛋白表達有關(guān)。已有研究［9］證實，As2O3不僅對急性早幼粒細胞性白血病有作用，對多數(shù)實體瘤也有效，如乳腺癌、胃癌、肺癌等。三氧化二砷是否靶向PML基因參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展值得研究。

本研究旨在研究As2O3對三陰性乳腺癌細胞增殖的影響及其與PML表達的相關(guān)關(guān)系的進一步研究，為As2O3的Ⅲ期臨床試驗提供更多的理論依據(jù)，該研究更深遠的意義還在于開創(chuàng)了針對引起三陰性乳腺癌起始細胞的靶向藥物研究。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，保存于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心實驗室。

1.2 主要試劑胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒和SYBR Green 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；PML引物和β-actin引物購自上海生工公司；PML抗體和β-actin抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購自武漢博士德公司；碘化丙啶試劑購自美國Sigma公司等。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞用DMEM細胞培養(yǎng)基(含有體積分數(shù)10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制PML在MDA-MB-231細胞中的表達 針對目的基因PML的序列，根據(jù)核糖核酸干擾(ribonucleic acid interference，RNAi)序列設(shè)計原則，設(shè)計3個PML敲低(PML knockdown，PML-KD)靶點序列，選擇最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點進入后續(xù)實驗流程。與工具載體pGV115進行酶切，PCR擴增目的基因PML，構(gòu)建病毒載體框架，合成單鏈引物，退火形成雙鏈DNA，通過T4 DNA ligase將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA連接，16 ℃連接1～3 h，或連接過夜構(gòu)建重組載體。將攜帶目的基因PML靶點序列的pGV115、病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 1.0和病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染293T細胞，在轉(zhuǎn)染完成后的48～72 h進行病毒收獲，采用相應(yīng)的濃縮純化得到高滴度的慢病毒保存液，測定慢病毒的滴度。將PML RNAi慢病毒感染MDA-MB-231細胞，用嘌呤霉素篩選陽性感染細胞。在MDA-MB-231細胞中進行PML RNAi慢病毒有效靶點的內(nèi)源性驗證，每組細胞設(shè)置3個重復(fù)，實驗重復(fù)2次。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測PML基因的表達 用TRIzol提取MDA-MB-231細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用于實時熒光定量PCR實驗檢測PML基因的表達。PML引物：正向-ACATCTTCTGCTCCAACCCC；反向-GCCAAAGGCACTATCCTGCT。β-actin引物：正向- GCGTGACATTAAGGAGAAGC；反向- CCACGTCACACTTCATGATGG。反應(yīng)體系為：cDNA 0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR緩沖溶液29.25 μL，Real Master Mix 35.7 μL，雙蒸水 33.85 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min，30個循環(huán)：94 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s。采用2-ΔΔCt法計算PML基因的mRNA相對表達量。

1.3.4 Western blot檢測蛋白的表達 培養(yǎng)MDA-MB-231細胞至對數(shù)生長期，磷酸鹽緩沖液洗滌2次。取適當(dāng)量的RIPA裂解液，使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入苯甲基磺酰氟，使苯甲基磺酰氟的最終濃度為1 mmol/L。用RIPA裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，4 ℃、12 000 g，離心15 min，用BCA法測定蛋白濃度。加入1/5體積的上樣緩沖液混勻，100 ℃ 10 min，短暫離心后-80 ℃保存?zhèn)溆?。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣進行電泳，調(diào)節(jié)電泳儀參數(shù)為：濃縮膠 80 mA，20 min；分離膠120 mA，1 h。電泳結(jié)束后，4 ℃、300 mA恒流條件下進行電轉(zhuǎn)150 min， 將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用封閉液(含體積分數(shù)5%脫脂牛奶的TBST溶液)4 ℃過夜封閉聚偏氟乙烯膜，然后將聚偏氟乙烯膜與一抗進行4 ℃過夜孵育，用TBST洗膜3次，每次5 min；與二抗室溫下孵育2 h，并用TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL發(fā)光液進行顯影，用Image J軟件對Western blot條件進行灰度分析，分析目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶的凈光密度值以及透明的比值。

1.3.5 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，并計數(shù)。將細胞接種于96孔板中(2 000個/孔)，每組設(shè)3個重復(fù)孔，過夜培養(yǎng)至融合度達80%～90%。每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。按照以下公式計算PML沉默后對食管鱗癌細胞增殖的影響，細胞抑制率=(對照孔平均光密度值-實驗孔平均光密度值/對照孔平均光密度值)×100%。

1.3.6 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞胰酶消化，用完全培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液計數(shù)。將細胞接種于6孔板培養(yǎng)板中(800個/孔)，每個實驗組設(shè)3個復(fù)孔。將接種好的細胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到14 d或絕大多數(shù)單個克隆中細胞數(shù)大于50為止，中途每隔3 d進行換液并觀察細胞狀態(tài)。用熒光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞1次。每孔加入1 mL質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛，固定細胞30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞1次。每孔加入結(jié)晶紫染液1 mL染細胞10 min。雙氧水洗滌細胞數(shù)次，熒光顯微鏡觀察并對克隆進行計數(shù)。

1.3.7 Transwell侵襲小室實驗檢測細胞侵襲遷移能力 MDA-MB-231細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將Transwell侵襲小室置于新的24孔板中，上、下小室各加500 μL無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中放置2 h使Matrigel基質(zhì)層再水化。制備無血清細胞懸浮液并計數(shù)，接種細胞于24孔板(105個/孔)，小心除去上室中培養(yǎng)基并加入200 μL細胞懸液，下室內(nèi)加入750 μL體積分數(shù)30%胎牛血清培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非侵襲細胞，遷移的細胞用多聚甲醛固定并用質(zhì)量分數(shù)0.1%結(jié)晶紫染色。每個小室隨機選取視野拍照，計算各組侵襲轉(zhuǎn)移細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抑制PML基因的表達對MDA-MB-231細胞增殖、侵襲遷移的影響用慢病毒介導(dǎo)的PML RNAi觀察抑制抑制PML基因的表達對MDA-MB-231細胞增殖、侵襲遷移的影響。相對于陰性病毒干擾(negative Control，NC)組，PML-RNAi慢病毒都能降低PML在MDA-MB-231細胞中的mRNA表達水平(F=19.203，P=0.001)，其中PML-KD2在MDA-MB-231細胞中對PML基因的敲減效果最高，達到83.9%，故選取PML-KD2進行后續(xù)試驗研究。CCK8檢測結(jié)果表明，與NC組相比，PML-KD組細胞生長速度減慢，倍增時間延長。PML-KD組對細胞的生長具有抑制作用，其細胞的增殖明顯低于NC組(t=37.757，P<0.001)，說明沉默PML的表達可以降低MDA-MB-231細胞的增殖。與NC組比較，抑制PML的表達MDA-MB-231細胞的克隆數(shù)量減少(t=25.080，P<0.001)，說明PML可以促進MDA-MB-231細胞的增殖。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，與NC組比較，PML-KD組遷移到下室的MDA-MB-231細胞數(shù)減少(t=176.000，P<0.001)，表明PML沉默抑制了MDA-MB-231細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。見圖1～4。

圖1 MDA-MB-231細胞中PML RNAi慢病毒有效靶點的篩選

A：PMLRNAi慢病毒感染293T細胞；B：PML-RNAi慢病毒感染MDA-MB-231細胞；C：PML在MDA-MB-231細胞中mRNA的表達豐度柱狀圖

2.2 As2O3聯(lián)合PML-KD對MDA-MB-231細胞增殖的影響鑒于慢病毒介導(dǎo)的PML基因干擾可以抑制MDA-MB-231細胞的增殖，As2O3和PML基因干擾之間是否存在協(xié)同效果尚不清楚，因此本研究將As2O3聯(lián)合PML短發(fā)夾RNA處理MDA-MB-231細胞，觀察細胞增殖的變化。本研究用As2O3(75 μmol/L)分別處理NC和PML-KD慢病毒感染的MDA-MB-231細胞(NC+As2O3組和PML-KD+As2O3組)。CCK-8結(jié)果顯示，各處理組MDA-MB-231細胞增殖比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3571.851，P<0.001)，PML-KD+As2O3聯(lián)合處理組的細胞生長最慢，與NC+As2O3組、PML-KD組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，說明聯(lián)合處理組對細胞生長的抑制作用最高。見圖5。

圖2 抑制PML的表達對MDA-MB-231細胞增殖的影響

圖3 抑制PML的表達對MDA-MB-231細胞克隆形成的影響

圖4 Transwell小室實驗檢測抑制

A：抑制PML的表達MDA-MB-231細胞的Transwell小室遷移到下室的細胞；B、C：Transwell小室遷移到下室的細胞柱狀圖

圖5 As2O3聯(lián)合PML-KD對MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.3 As2O3聯(lián)合PML-KD對MDA-MB-231細胞克隆形成的影響克隆形成實驗結(jié)果顯示，各處理組MDA-MB-231細胞增殖比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=744.177，P<0.001)。PML-KD+ As2O3組MDA-MB-231細胞的克隆形成數(shù)量最低，與NC+As2O3組、PML-KD組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，說明As2O3和PML-KD處理對MDA-MB-231細胞克隆形成能力具有協(xié)同效果。見圖6。

圖6 As2O3聯(lián)合PML-KD對

A：克隆形成實驗結(jié)果；B：克隆形成實驗綠色熒光圖；C：克隆形成實驗的柱狀圖

2.4 As2O3聯(lián)合PML-KD對MDA-MB-231細胞侵襲遷移的影響Transwell小室結(jié)果顯示，各處理組MDA-MB-231細胞遷移比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6 363.307，P<0.001)。PML-KD+ As2O3組遷移至下室的MDA-MB-231細胞數(shù)最少，與NC+As2O3組、PML-KD組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，說明As2O3聯(lián)合PML-KD對MDA-MB-231細胞侵襲遷移能力的抑制具有協(xié)同作用。見圖7。

圖7 As2O3聯(lián)合PML-KD對

3 討論

有研究［10］顯示，PML分子有潛在抗癌能力，PML可以將腫瘤抑制蛋白組構(gòu)成一個網(wǎng)絡(luò)來抑制腫瘤細胞的表達，或抑制腫瘤細胞增殖所需的其他蛋白質(zhì)的數(shù)量，這些蛋白質(zhì)在體內(nèi)是最基本的分子，發(fā)揮著控制細胞誕生、生長、死亡的作用。本研究通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi抑制PML在MDA-MB-231細胞中的表達，可以降低細胞的增殖和侵襲遷移能力。

已有研究［11-15］證實As2O3不僅對急性早幼粒細胞性白血病有作用，對多數(shù)實體瘤也有效，如乳腺癌、胃癌、肺癌等。鑒于慢病毒介導(dǎo)的PML基因干擾可以抑制MDA-MB-231細胞的增殖，As2O3和PML基因干擾之間是否存在協(xié)同效果尚不清楚，因此本研究將As2O3聯(lián)合PML-KD處理MDA-MB-231細胞，觀察細胞增殖和侵襲遷移的變化。As2O3聯(lián)合PML-KD處理組對MDA-MB-231細胞的增值能力和克隆形成能力最低，可以抑制細胞的侵襲遷移能力，說明聯(lián)合處理對細胞生長的抑制作用最高。

我們的研究結(jié)果證實，抑制PML在MDA-MB-231細胞中的表達可以降低細胞的增殖和侵襲遷移能力，As2O3可以增強PML對細胞增殖和侵襲遷移能力的抑制作用，可能成為三陰性乳腺癌新的治療的靶點。