陳芳，王曼知，危松青，李嘉，石家云，張小佛

（南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院 兒科，湖南 長(zhǎng)沙410004）

川崎?。↘awasaki disease, KD）是一種急性發(fā)熱性、血管炎癥疾病，最常累及冠狀動(dòng)脈，是兒童后天獲得性心臟病的主要原因之一。雖然從日本學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)KD 至今已有50 多年的歷史，但KD及其引起的心血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。氧化應(yīng)激可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，引起內(nèi)皮下層及中膜組織變薄，導(dǎo)致血管緊張度降低及遠(yuǎn)期心血管事件的發(fā)生[1-2]。氧化應(yīng)激是一種由各種原因所致的氧化和抗氧化的失衡狀態(tài)，在KD 及其并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的發(fā)病機(jī)制中有重要作用[2]。而對(duì)氧磷酶1（Paraoxonase-1,PON1）是一種抗氧化酶，在維持體內(nèi)氧化-抗氧化平衡中起關(guān)鍵作用。國(guó)內(nèi)外研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，PON1 部分基因多態(tài)性與全身氧化應(yīng)激和心血管事件相關(guān)，但有關(guān)PON1 與KD 及其并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的關(guān)系研究甚少。本研究選取PON1基因多態(tài)性的位點(diǎn)rs662、rs3917541、rs3917539，探討PON1基因位點(diǎn)多態(tài)性與KD 及其并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年1月—2018年12月在南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院兒科住院的93 例KD 患兒（KD 組），男∶女為1.58∶1，年齡2 個(gè)月～7 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒均符合KD 診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡≤14 歲；③入院前均未使用丙種球蛋白及阿司匹林治療；④能接受規(guī)律門診復(fù)診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不完善；②既往有KD、感染性疾病、心血管疾病、風(fēng)濕免疫性疾病史。根據(jù)超聲心動(dòng)圖結(jié)果，KD 組又分為合并冠狀動(dòng)脈損害組（15 例）和未合并冠狀動(dòng)脈損害組（78 例）。KD 合并冠狀動(dòng)脈損害的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：Z 值＜2，為無(wú)受累；2 ≤Z 值＜2.5，或初始Z 值＜2、隨訪時(shí)Z 值下降幅度≥1，為僅擴(kuò)張；2.5 ≤Z 值＜5，為小型冠狀動(dòng)脈瘤；5 ≤Z 值＜10，同時(shí)內(nèi)徑絕對(duì)值＜8 mm，為中型冠狀動(dòng)脈瘤；Z 值≥10 或內(nèi)徑絕對(duì)值≥8 mm，為巨大冠狀動(dòng)脈瘤。選取同時(shí)間段在該院體檢的94 例正常兒童為對(duì)照組，男∶女為1.69∶1，年齡3 個(gè)月～9 歲。排除既往KD、感染性疾病、心血管疾病、風(fēng)濕免疫性疾病等病史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA 采用含5%的EDTA-Na2抗凝劑的一次性采血管，抽取所有研究對(duì)象的外周靜脈血2 mL，置于-80℃冰箱冷凍保存。應(yīng)用DNA 試劑盒（美國(guó)Promega 公司）提取血液標(biāo)本中的基因組DNA，并測(cè)定其濃度和純度，合格樣本置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測(cè) 從PubMed 網(wǎng)站GenBank系統(tǒng)中查詢PON1基因的堿基序列，采用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)包含PON1基 因rs662、rs3917541、rs3917539 位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增特異性引物。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法（PCR-SBT）檢測(cè)所有研究對(duì)象PON1基 因rs662、rs3917541、rs3917539 位點(diǎn)的基因型。引物序列由擎科生物技術(shù)有限公司合成，正向5'-GTATCCAGGCTGCTGGTTCA-3'，反向5'-CGAGTGGTGGCAGAAGGATT-3'。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：模 板DNA 2.0 μL，正向引物0.5 μL（10 μmol/L），反向引物0.5 μL（10 μmol/L），2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，去離子水9.5 μL。采用美國(guó)ABI PCR 9700 擴(kuò)增儀（上海賽默生物科技發(fā)展有限公司）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外燈下照相并記錄電泳圖譜，擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物由長(zhǎng)沙貝博生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)組間基因型頻率平衡吻合度； 以直接計(jì)數(shù)法計(jì)算PON1基因rs662、rs3917541、rs3917539 位點(diǎn)各種基因型頻率和等位基因頻率；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PON1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

采用PCR 擴(kuò)增PON1基因，該產(chǎn)物為618 bp，結(jié)果與預(yù)期一致。見圖1。

圖1 PON1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 PON1基因rs662位點(diǎn)多態(tài)性

PON1基因rs662 位點(diǎn)多態(tài)性表現(xiàn)為A 突變?yōu)镚，AA 型、AG 型、GG 型均可見。見圖2。

圖2 PON1基因rs662位點(diǎn)測(cè)序圖

2.3 PON1基因rs3917541位點(diǎn)多態(tài)性

PON1基因rs3917541 位點(diǎn)多態(tài)性表現(xiàn)為C 突變?yōu)門，CC 型、CT 型、TT 型均可見。見圖3。

圖3 PON1基因rs3917541位點(diǎn)測(cè)序圖

2.4 PON1基因rs3917539位點(diǎn)多態(tài)性

PON1基因rs3917539 位點(diǎn)多態(tài)性表現(xiàn)為TT 型（插入型）、--（缺陷型）、-/T 型（缺陷/插入型）均可見。見圖4。

圖4 PON1基因rs3917539位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖

2.5 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)組間基因型頻率平衡吻合度。KD 組PON1基因rs662、rs3917541、rs3917539 位點(diǎn)基因型頻率分布（χ2=0.036、0.001 和0.020，P=0.981、0.999 和0.990），對(duì) 照 組PON1基 因rs662、rs3917541、rs3917539 位點(diǎn)基因型頻率分布（χ2=0.118、0.187 和0.009，P=0.942、0.910 和0.995），均 符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有群體代表性。

2.6 PON1 基因rs662、rs3917541、rs3917539位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布的比較

2.6.1 rs662 位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布 KD 組與對(duì)照組PON1基因rs662 位點(diǎn)AA、AG、GG基因型頻率分布和A、G 等位基因頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。KD 組中合并冠狀動(dòng)脈損害組與未合并冠狀動(dòng)脈損害組PON1基因rs662 位點(diǎn)AA、AG、GG 基因型頻率分布和A、G 等位基因頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

表1 KD組和對(duì)照組rs662位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較 例（%）

表2 合并冠狀動(dòng)脈損害組和未合并冠狀動(dòng)脈損害組rs662位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較 例（%）

2.6.2 rs3917541 位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布 KD 組與對(duì)照組PON1基因rs3917541 位點(diǎn)CC、CT、TT 基因型頻率分布和C、T 等位基因頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表3）；KD組中合并冠狀動(dòng)脈損害組與未合并冠狀動(dòng)脈損害組PON1基因rs3917541 位點(diǎn)CC、CT、TT 基因型頻率分布和C、T 等位基因頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表4）。

表3 KD組和對(duì)照組rs3917541位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較 例（%）

表4 合并冠狀動(dòng)脈損害組和未合并冠狀動(dòng)脈損害組rs3917541位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較 例（%）

2.6.3 rs3917539 位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布 KD 組與對(duì)照組PON1基因rs3917539 位點(diǎn)TT、--、-/T 基因型頻率分布和-、T 等位基因頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表5）。KD 組中合并冠狀動(dòng)脈損害組和未合并冠狀動(dòng)脈損害組PON1基因rs3917539 位點(diǎn)TT、--、-/T 基因型頻率分布和-、T 等位基因頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表6）。

表5 KD組和對(duì)照組rs3917539位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較 例（%）

表6 合并冠狀動(dòng)脈損害組和未合并冠狀動(dòng)脈損害組的rs3917539位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較 例（%）

3 討論

氧化與抗氧化失衡可以導(dǎo)致多種疾病，如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱冠心?。?、糖尿病、川崎病等。川崎病是一種兒童常見的急性發(fā)熱出疹性疾病，已成為小兒后天性心臟病的主要病因，且與成年后心血管疾病關(guān)系密切[5]。KD的主要危害是心血管并發(fā)癥，特別是冠狀動(dòng)脈，如不經(jīng)及時(shí)治療，20%～25%的患兒會(huì)發(fā)生心血管病變，主要包括冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈瘤、冠狀動(dòng)脈狹窄，甚至心肌梗死等[6]。目前KD 的病因及發(fā)病機(jī)制未明，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)KD 及其冠狀動(dòng)脈損害可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，KD 患兒體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，且并發(fā)冠狀動(dòng)脈損害患兒的活性氧類物質(zhì)含量明顯升高[2，7]。

PON1 是一種具有抗氧化作用的內(nèi)酯酶，廣泛分布于機(jī)體各組織中，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，PON1 能阻止機(jī)體的過(guò)度氧化反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免于氧化損傷[8]。許多研究表明PON1 可以通過(guò)多種途徑參與心血管疾病的調(diào)控。首先，PON1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的膽固醇流出來(lái)發(fā)揮心血管保護(hù)作用[9]。其次，PON1 還可能在調(diào)節(jié)內(nèi)皮血管擴(kuò)張中起作用，PON1 可以穿透內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流顯著降低血管舒張[10]。再次，過(guò)度的氧化應(yīng)激狀態(tài)是心血管疾病重要的病理生理事件，PON1 可以通過(guò)抗氧化作用，對(duì)過(guò)度的氧化應(yīng)激具有很好的調(diào)節(jié)作用[11]。

臨床研究也提示，PON1 在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。VAISAR 等[12]通過(guò)對(duì)1 型糖尿病患者橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，1 型糖尿病長(zhǎng)期無(wú)心血管并發(fā)癥患者較合并心血管并發(fā)癥患者PON1 水平更高，表明PON1 可能具有心血管保護(hù)作用。嚴(yán)為宏等[13]通過(guò)選擇接受頸動(dòng)脈超聲檢查的老年人112 例，并將其分為動(dòng)脈粥樣硬化組和非動(dòng)脈粥樣硬化組，老年人頸動(dòng)脈粥樣硬化患者中血清PON1 活性明顯低于對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，還發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的PON1 糖基化是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，抑制氧化應(yīng)激可以減輕糖尿病血管并發(fā)癥[14]。因此，PON1 與心血管疾病密切相關(guān)，PON1基因的改變也將影響心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。

PON1基因多態(tài)性與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、2 型糖尿病心血管并發(fā)癥相關(guān)。MURILLO-GONZáLEZ 等[15]通過(guò)比較分析心血管疾病組、心血管危險(xiǎn)因素組和正常對(duì)照組的PON1基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)PON1的CC-108 基因型與心血管疾病相關(guān)，提示PON1基因多態(tài)性與心血管疾病相關(guān)。ZHANG 等[16]對(duì)PON1Q192R 基因多態(tài)性與冠心病患者的關(guān)系進(jìn)行了Meta 分析，發(fā)現(xiàn)PON1Q192R基因多態(tài)性與中國(guó)冠心病患者有相關(guān)性。另外，有研究報(bào)道，PON1基因多態(tài)性是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[17]。胡道軍等[18]通過(guò)Meta 分析發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者并發(fā)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)與PON1192Gln/Arg基因多態(tài)性呈正相關(guān)，攜帶R 等位基因2 型糖尿病患者與攜帶Q 等位基因患者相比，前者更容易并發(fā)冠心病。RAHMAN 等[19]通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)192R 等位基因是早期心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些均表明PON1基因多態(tài)性與心血管疾病、某些自身免疫性疾病的心血管并發(fā)癥相關(guān)，而KD 正是一種自身免疫性血管炎癥疾病，心血管病變是其主要的并發(fā)癥，其發(fā)病可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。故而推測(cè)，PON1基因多態(tài)性亦可能與KD 及其心血管并發(fā)癥有關(guān)。

本研究采用PCR-SBT 法分析93 例KD 患兒和94例健康兒童PON1基因rs662、 rs3917541、rs3917539 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，KD 組和對(duì)照組比較、合并冠狀動(dòng)脈損害組和未合并冠狀動(dòng)脈損害組比較，基因型頻率分布及等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故PON1基因rs662、rs3917541 和rs3917539 位點(diǎn)多態(tài)性可能與KD 的發(fā)病及其冠狀動(dòng)脈損害的發(fā)生無(wú)關(guān)，也可能是因?yàn)楸狙芯繕颖玖坎粔虼?、存在抽樣誤差、種族和環(huán)境因素等差異所致。因此，PON1基因多態(tài)性是否與KD 的發(fā)病及其引發(fā)的冠狀動(dòng)脈損害有關(guān)，還需要對(duì)其他多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行研究，或通過(guò)增加樣本量進(jìn)行多中心的研究。