劉計濤，王夢詩，索海翠，羅煥明，王 麗，李成晨，單建偉，廖永珊，李小波

（廣東省農業(yè)科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】馬鈴薯（Solanum tuberosum）是我國重要的糧菜兼用作物，總產量和種植面積均居世界首位，在保證國家糧食安全和蔬菜周年供應中發(fā)揮重要作用，是高效農業(yè)的重要組成部分。馬鈴薯為喜冷涼不耐低溫作物，容易遭受冬春季自然寒害，嚴重影響產量。茉莉酸是重要的植物激素之一，在調節(jié)非生物脅迫和生物脅迫中發(fā)揮了重要的功能，但關于茉莉酸影響馬鈴薯抗寒性的研究還較少，因此，探索茉莉酸對馬鈴薯低溫脅迫耐性的影響，有助于解析馬鈴薯抗寒生理機制，并為其在生產中推廣應用提供參考。【前人研究進展】低溫脅迫是威脅溫帶和熱帶植物的主要環(huán)境因素之一［1］，會導致植物中活性氧（ROS）過度積累造成核酸、蛋白質和脂質等大分子物質的氧化損傷，最終破壞細胞功能，造成植物死亡［2］［3］。茉莉酸（JA）是一種重要的植物激素，其參與調節(jié)許多生理進程，如根抑制［4］、花青素積累［5］、毛狀體形成［6］、雄性發(fā)育［7-8］、葉片衰老［9-11］、生物和非生物脅迫響應等［12-16］。前人的研究表明，外源處理MeJA 能夠顯著提升模式植物擬南芥在非冷馴化條件下的抗寒性［17］，以及冷脅迫下水稻幼苗的存活率［18］，在番茄中JA 能夠促進腐胺的合成降低氧化脅迫提高低溫脅迫耐性［19］。外源JA 處理能夠通過緩解氧化脅迫，維持細胞穩(wěn)態(tài)和提高抗氧化能力增強紫蘇、顛茄、小麥的抗寒性［20-22］。ICE（Inducer of CBF expression）—CBF 轉錄調節(jié)模塊在植物低溫脅迫響應中起著重要的作用［23］，在擬南芥中低溫脅迫能夠激活ICE-CBF 蛋白誘導大量的COR（Coldregulated）基因的表達，最終提升擬南芥的低溫脅迫耐性［24］。有研究報道，JA 能夠正調節(jié)ICE-CBF 通路，增強擬南芥的低溫脅迫耐性［17］。這些研究表明，JA 在調節(jié)植物低溫脅迫耐性中發(fā)揮重要的功能。在馬鈴薯中，前人的研究發(fā)現(xiàn)JA能夠提升馬鈴薯對晚疫病的抗性［25］，影響塊莖發(fā)育等［26］，而關于JA 調節(jié)馬鈴薯抗寒性的研究還較少。因此，探索JA 調節(jié)馬鈴薯抗寒的機制對于馬鈴薯抗寒育種和栽培具有重要意義。【本研究切入點】以馬鈴薯冬作區(qū)主栽品種費烏瑞它為研究對象，針對冬作區(qū)寒害頻發(fā)嚴重影響產量這一現(xiàn)狀，以及農民對馬鈴薯抗寒栽培技術和品種的需求，利用外源JA 處理并通過酶活性分析和抗寒相關基因CBF的表達模式確定馬鈴薯最適JA 使用濃度。【擬解決的關鍵問題】探討JA 調節(jié)馬鈴薯低溫脅迫耐性的最適濃度，以及其對馬鈴薯活性氧及其清除酶的影響，揭示JA 影響馬鈴薯抗寒性的生理特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種為費烏瑞它，種薯購自天津市天興佳業(yè)科技有限公司，保存于冷庫中，試驗前放置于室內待種薯發(fā)芽后切塊，在實驗室光照培養(yǎng)室進行盆栽；供試盆規(guī)格為盆底直徑22 cm，高25 cm，盆口直徑30 cm；基質為草炭土混合珍珠巖比例為2∶1。

茉莉酸購自上海麥克林生化科技有限公司，用適量無水乙醇徹底溶解后，再緩慢加入水定容至0.1 mol/L作為母液，然后根據(jù)試驗所需濃度（50、100、200、400 μmol/L）進行稀釋定容，以去離子水作對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理與采集 試驗于2021 年9 月11日在廣東省農作物遺傳改良重點實驗室進行，馬鈴薯出苗2 周的盆栽苗，每盆保留1～2 棵長勢一致的幼苗，繼續(xù)在長日照（光照16 h）條件下培養(yǎng)2 周后備用。選取25 盆長勢一致的馬鈴薯盆栽苗平均分為5 組，每組5 個生物學重復，分別用50、100、200、400 μmol/L 茉莉酸和去離子水噴施葉片，24 h 后放入低溫光照培養(yǎng)箱（達斯卡特DGZC-P1000B），以-2 ℃低溫脅迫處理5 h，分別選取處理0、5 h 頂部生長第3～4 片功能葉置于液氮中，用于下一步分析。

1.2.2 測定項目及方法 過氧化氫含量：采用過氧化氫含量檢測試劑盒（BC3590，北京索寶萊科技有限公司），將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末，稱取0.1 g 加入1 mL 丙酮提取液并迅速渦旋震蕩混勻，并置于冰上10 min 充分反應，4 ℃、8 000 g 離心10 min，取全部上清液，置冰上待測，然后參照試劑盒測定方法，用分光光度計進行測定，調整波長至415 nm，記錄吸光值，蒸餾水調零。計算公式為：

H2O2（μmol/g ）=ΔA測定÷ΔA標準÷W

式中，ΔA測定=A測定管-A空白管，ΔA標準=A標準管-A空白管，A 為波長415 nm 處吸光度OD415，W 為樣品質量（g）。

馬鈴薯過氧化氫酶（CAT）活性：采用過氧化氫酶活性檢測試劑盒（BC0200，北京索寶萊科技有限公司），將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末，稱取0.1 g 樣本加入1 mL 提取液并迅速渦旋震蕩混勻，并置于冰上10 min，4 ℃、8 000 g 離心10 min，取全部上清液，置冰上待測，然后參照試劑盒測定方法，用分光光度計進行測定，調整波長至240 nm，記錄吸光值，蒸餾水調零。取1 mL CAT 檢測工作液于1 mL 石英比色皿中，再加入35 μL 酶提取液，混勻5 s，室溫下立即測定240 nm 下的初始吸光值A1 和1 min 后的吸光值A2。

CAT 活性（U/g ）=678×ΔA÷W

式中，ΔA=A1-A2，A 為波長240 nm 處吸光度OD240，W 為樣品質量（g）。

馬鈴薯過氧化物酶（POD）活性：采用過氧化物酶活性檢測試劑盒（BC0090，北京索寶萊科技有限公司），將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末，稱取0.1 g 樣本加入1 mL 提取液并迅速渦旋震蕩混勻，并置于冰上10 min，4 ℃、8 000 g 離心10 min，取全部上清液，置冰上待測，然后參照試劑盒測定方法，用分光光度計進行測定，調整波長至470 nm，記錄吸光值，蒸餾水調零。在1 mL 玻璃比色皿中按順序加入試劑盒試劑，立即混勻并計時，記錄470 nm 下30 s 的吸光值A1 和90 s 后的吸光值A2。

POD 活性（U/g ）=7133×ΔA÷W，ΔA=A2-A1

超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒（BC0170，北京索寶萊科技有限公司），將馬鈴薯葉片于液氮中研磨成粉末，稱取0.1 g 樣本加入1 mL 提取液并迅速渦旋震蕩混勻，并置于冰上10 min，4 ℃、8 000 g離心10 min，取全部上清液，置冰上待測，然后參照試劑盒測定方法，加入測定試劑后充分混勻，37 ℃水浴30 min 后，置于1 mL 玻璃比色皿測定560 nm 下的吸光度，蒸餾水調零。

式中，ΔA測定=A測定-A對照，ΔA空白=A1空白-A2空白，A 為波長560 nm 處吸光度OD560，W 為樣品質量（g）。

1.2.3 基因表達分析 分別在Solanaceae Genomics Resource網(wǎng)站（www.spuddb.uga.edu/index.shtml）數(shù)據(jù)庫獲得MYC2和CBF1-3的序列，利用NCBI Primer Blast進行引物設計（表1）和特異性比對分析。以JA處理馬鈴薯葉片提取的RNA，利用反轉錄試劑盒（擎科，Code No.TSK302M）得到cDNA模板，采用2×TSINGKE?Master qPCR Mix（SYBR Green I with UDG）（擎科，Code No.TSE203）進行實時熒光定量（QRT-PCR）分析，ef1a作為內參基因，獲得不同基因的相對表達量，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。每個樣品3次生物學重復，3次技術重復。

表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

2 結果與分析

2.1 JA 對馬鈴薯活性氧含量的影響

由圖1 可知，JA 處理24 h 后馬鈴薯葉片過氧化氫的含量隨著JA 濃度的增加顯著降低，對照過氧化氫含量最高為0.856 μmol/g，其中50 μmol/L JA 處理過氧化氫含量略有降低但不顯著，100 μmol/L JA 處理后開始顯著降低，以200 μmol/L JA處理后達到最低點0.275 μmol/g，400 μmol/L JA處理比200 μmol/L JA 處理略有升高但均比對照顯著降低；經(jīng)低溫脅迫4 h 后，與低溫脅迫前相比過氧化氫含量均顯著升高，且趨勢與低溫脅迫前一致，其中對照的過氧化氫含量仍是最高、為2.176 μmol/g，200 μmol/L JA 處理最低、為1.139μmol/g。這表明JA 濃度為200 μmol/L 的處理效果最好，其次為400 μmol/L。

圖1 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下過氧化氫含量的影響Fig.1 Effects of different JA concentrations on hydrogen peroxide content under cold stress

2.2 JA 對活性氧清除酶活性的影響

2.2.1 過氧化氫酶（CAT）活性 由圖2 可知，JA 處理24 h 后，馬鈴薯葉片CAT 活性總體隨著JA 濃度增加而增強，與蒸餾水對照相比，50 μmol/L JA 處理4 h 后CAT 活性由163.01 μmol/g 增加至325.07 μmol/g，顯著增強1.99 倍，100、200、400 μmol/L JA 處理的CAT 活性比50 μmol/L JA 處理略有升高但不顯著，分別為對照的2.16、2.31、2.33 倍；低溫脅迫4 h 后，與脅迫前（0h）相比，蒸餾水對照的CAT 活性由163.01 μmol/g 增加至328.13 μmol/g，顯著增強2.01 倍，而50 μmol/L JA 處理的CAT 活性變化不明顯，但100、200、400 μmol/L JA 處理的CAT 活性顯著增強，分別為367.83、426.56、455.76 μmol/g，為對照的1.12、1.30、1.39 倍。表明200 μmol/L JA 處理效果最好，其次為100、400 μmol/L JA 處理。

圖2 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下CAT 活性的影響Fig.2 Effects of different JA concentrations on CAT activity under cold stress

2.2.2 過氧化物酶（POD）活性 如圖3 所示，與蒸餾水對照相比，50 μmol/L JA 處理24 h 后，馬鈴薯葉片POD 活性變化不顯著；當JA 濃度增加至100 μmol/L 時，POD 活性由89.59 U/g 顯著增加至171.73 U/g，為對照的1.3 倍；JA 濃度繼續(xù)增加至200、400 μmol/L 時，POD 活性分別為對照的2 倍（181.24 U/g）和2.1 倍（195.05 U/g）。低溫脅迫4 h 后POD 活性比0 h 顯著增強，與蒸餾水對照相比，50 μmol/L JA 處理的POD 活性略有增強但不顯著；JA 濃度增加至100 μmol/L 時，POD 活性比對照增強1.81 倍；200 μmol/L JA 處理的POD 活性顯著提升，為對照的2.53 倍；400 μmol/L JA 處理與200 μmol/L JA 處理效果相似，為對照的2.63 倍。表明低溫脅迫400 μmol/L JA處理的POD 活性最強，其次為200、100 μmol/L JA 處理。

圖3 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下POD 活性的影響Fig.3 Effects of different JA concentrations on POD activity under cold stress

2.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性 如圖4 所示，將馬鈴薯植株進行JA 處理24 h 后，與蒸餾水對照（SOD 活性為166.32 U/g）相比，50 μmol/L JA 處理的SOD 活性（151.52 U/g）沒有發(fā)生顯著變化，而100 μmol/L JA 處理后SOD 活性（108.61 U/g）降低35%，200、400 μmol/L JA 處理后SOD活性分別降低70.7%（SOD 活性為48.67 U/g）和61.4%（SOD 活性為64.12 U/g）；低溫脅迫處理4 h 后，與對照相比，50 μmol/L JA 處理的SOD 活性沒有發(fā)生顯著變化，但100 μmol/L JA 處理后SOD 酶活性增強32.8%，200、400 μmol/L JA 處理后SOD 活性分別增強64.4%和112.6%。表明在正常條件下JA 處理抑制了SOD 活性，且以200 μmol/L 效果最顯著，而在低溫脅迫處理后，SOD活性隨著JA 濃度的增加而增強。

圖4 不同JA 濃度處理對低溫脅迫條件下SOD 活性的影響Fig.4 Effects of different JA concentrations on SOD activity under cold stress

2.3 JA 對馬鈴薯CBF 基因表達的影響

如圖5 所示，馬鈴薯植株經(jīng)JA 和低溫脅迫處理后，檢測JA 響應Marker 基因MYC2的表達，結果發(fā)現(xiàn)，在正常條件下JA 處理促進了MYC2 基因的表達，并且在100 μmol/L JA 處理后達到峰值，為對照的4.3 倍；進一步進行低溫脅迫處理4 h，MYC2 的表達與0 h 相比均有顯著地增強，其中100、200、400 μmol/L JA 處理分別比對照增強2.17、2.28、2.31 倍，表明JA 處理結果是可靠的。隨后分別對馬鈴薯CBF1、CBF2和CBF3的表達進行分析，結果（圖5）顯示，JA 處理24 h 后誘導3個CBF基因的表達，其中CBF1基因的表達在100 μmol/L JA 處理后達到最強，CBF2基因的表達在200 μmol/L JA 處理后最高，CBF3基因則在400 μmol/L JA 處理后效果最好；進一步的低溫脅迫處理4 h 后，發(fā)現(xiàn)3 個CBF基因的表達與0 h 對比均有顯著誘導，與對照相比，CBF1、CBF2、CBF3基因的表達在分別在50、100 μmol/L JA 處理后效果最好。表明JA 處理能夠增強抗寒關鍵基因CBF的表達，進一步提升馬鈴薯的抗寒性。

圖5 不同JA 濃度處理及低溫脅迫對StCBFs 基因表達的影響Fig.5 Effects of different JA concentrations on the expression of StCBFs under cold stress

3 討論

低溫是限制植物生長、種群地理分布和農藝性狀的重要環(huán)境因子［27］。許多植物已經(jīng)進化出適應低溫氣候的能力，并表現(xiàn)出局部的適應性狀［28］。低溫脅迫會誘導植物產生大量的活性氧（ROS），進而造成植物膜脂過氧化，細胞膜系統(tǒng)損傷，甚至細胞死亡，最終會影響植物的正常生長［29］。在許多植物中已經(jīng)有研究表明，JA 參與調節(jié)ROS 的平衡機制，并且是通過影響ROS清除酶的活性實現(xiàn)的。本研究以馬鈴薯植株為研究對象，通過監(jiān)測不同濃度JA 對低溫脅迫條件下馬鈴薯植株ROS 清除酶活性的影響，篩選提升馬鈴薯植株抗寒性最適的JA 濃度，旨在為實踐生產中應用JA 提供一定參考。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著JA 處理濃度的提升，馬鈴薯葉片中過氧化氫的含量顯著降低，并且以200 μmol/L JA 處理效果最明顯，而低溫脅迫處理后各處理的過氧化氫含量均顯著增加，但100、200、400 μmol/L JA處理的過氧化氫含量顯著低于對照，表明JA 能夠顯著抑制過氧化氫的積累。同樣地，進一步分析ROS 清除機制中的3 種酶的活性，發(fā)現(xiàn)100、200 μmol/L JA 處理后CAT、POD 活性顯著升高，表明JA 通過調節(jié)CAT 和P OD 活性［30］來調節(jié)馬鈴薯葉片細胞內ROS 的平衡，進而影響抗寒性；然而，SOD 活性在常溫和低溫脅迫條件下呈現(xiàn)出相反的趨勢，這可能是由于常溫條件下JA 促進CAT 和POD 活性降低了過氧化氫的含量，進而導致SOD 活性維持在較低水平，而在低溫脅迫下過氧化氫含量顯著升高，促進了SOD 活性提升，且此時JA 起著正調節(jié)的作用［30-31］。

CBF家族基因是植物響應低溫脅迫的關鍵轉錄因子［23，32-33］。研究發(fā)現(xiàn)，在許多植物中，低溫脅迫能夠激活CBF1-3的積累，并激活其下游COR（Cold-related）基因的表達，以提升植物的抗寒性［24,34］。JA 能夠正調節(jié)ICE-CBF 信號途徑，增強植物的抗寒性［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，在馬鈴薯中，JA 處理能夠誘導JA 信號Marker 基因MYC2的表達，表明JA 處理結果可靠；進一步對CBF1-3的表達進行分析表明，JA 處理能夠促進CBF1-3的表達，以100、200 μmol/L JA 處理效果最為顯著。經(jīng)低溫脅迫處理后，與正常條件相比，3 個CBF基因的表達均被誘導上調，以50、100 μmol/L JA處理表達最高，且CBF2變化倍數(shù)最高達500多倍，可能作為主效基因，其次為CBF1和CBF3。其原因可能是低溫脅迫促進了內源JA 的積累［29］，從而促進了CBF1-3基因的表達。

4 結論

本研究結果表明，低溫脅迫條件下外源JA處理能夠提升馬鈴薯葉片活性氧清除酶CAT、SOD 和POD 活性，抑制活性氧的積累，提升馬鈴薯的低溫脅迫耐性，并且在一定范圍內（0～400 μmol/L）隨著JA 濃度的增加ROS 清除酶的活性呈現(xiàn)出增強的趨勢；馬鈴薯適宜的茉莉酸處理濃度范圍為100～400 μmol/L，其中以200 μmol/L 效果最佳，此時能夠將活性氧清除酶CAT、POD 和SOD 活性分別提升30%、153%和64%，活性氧含量降低47.6%。此外，外源施加JA 能夠顯著促進抗寒關鍵基因StCBFs的表達，提升馬鈴薯的抗寒性，在實際生產中遭遇低溫寒潮時，可適當施用JA，減少損失。