馬柱文，屈玉嬌，潘曉英，陳俊標(biāo)，張振臣，李集勤，黃振瑞，袁清華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室/廣東省煙草育種與綜合利用工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640）

【研究意義】煙草青枯病是由雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細(xì)菌性病害，常暴發(fā)流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。病菌通常由開放性傷口入侵，有些情況下也從主根發(fā)生側(cè)根時產(chǎn)生的自然開口入侵，入侵后病菌進(jìn)入木質(zhì)部，迅速耗盡木質(zhì)部的氧氣并堵塞導(dǎo)管使水分運(yùn)輸受阻［2］，維管組織及木質(zhì)部變色，葉片枯萎，煙株凋亡［3］。該菌宿主范圍極廣，除煙草外，茄子、番茄、馬鈴薯等其他茄科作物均可侵染為害［4-5］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們對植物響應(yīng)病原菌的入侵有了更深入的了解［6］。Chen 等［7］對抗、感兩個茄子品種接種青枯病菌后的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，大部分差異表達(dá)基因?qū)儆谏镞^程類別，其中代謝過程和細(xì)胞過程的基因數(shù)目最多。接種青枯病菌后抗、感兩個品種的差異表達(dá)蛋白中有85 個屬于免疫應(yīng)答蛋白。Prasath等［8］對抗、感兩個生姜品種接種青枯病菌后的轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出抗性品種105 個基因在接種之后表達(dá)量上調(diào)，其中包含直接參與通過水楊酸（SA）介導(dǎo)的超敏反應(yīng)、系統(tǒng)性獲得和細(xì)胞凋亡反應(yīng)抵御病原菌的重要基因。利用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，Park 等［9］發(fā)現(xiàn)馬鈴薯青枯病抗性品種CT206-10 中富甘氨酸RNA 結(jié)合蛋白（Glycinerich RNA binding protein，GRP）、番茄脅迫誘導(dǎo)-1蛋白（Tomato stress induced-1 protein，TSI-1）、發(fā)病相關(guān)（Pathogenesis-related，STH-2）蛋白等8 個響應(yīng)青枯病菌入侵的差異蛋白。利用相同技術(shù)，Afroz 等［10］從青枯病菌接種番茄抗、感兩個品種中鑒定出9 個差異表達(dá)蛋白，與感病品種相比，其中的60 ku 伴侶蛋白和Rubisco 活化酶在抗性品種中顯著上調(diào)?！颈狙芯壳腥朦c】大葉密合是廣東封開縣主栽曬煙品種，為名優(yōu)晾曬煙品種之一，對青枯病具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的抗性［11-13］。SSR 遺傳圖譜分析顯示大葉密合的6 個QTL 不同于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗源［14］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用同位素相對和絕對定量標(biāo)記（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）方法研究大葉密合接種青枯病菌后的蛋白質(zhì)表達(dá)量變化，旨在探尋與抗青枯病相關(guān)的功能蛋白及代謝途徑，為煙草抗青枯病分子機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為大葉密合、D101（抗病對照品種）和長脖黃（感病對照品種），均來源于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理及采集 2019 年7 月15 日播種，人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度27 ℃、濕度80%、光照強(qiáng)度12 000 lx。煙苗生長至具有6 片真葉成苗期時，采用傷根灌菌法接種青枯病菌。試驗設(shè)置高致病力菌株203（生化型Ⅲ）、低致病力菌株204（生化型亞型Ⅲ-1）［15］以及無菌水處理3 個處理，每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)種植12 株，每株淋灌150 mL 細(xì)菌懸浮液，濃度為3.9×108CFU/mL，分別在接菌處理0、3、6、9、

12 h 取新鮮葉片用于RNA 表達(dá)量分析，取樣部位為成苗期最長葉（第5 片葉）。感病對照品種長脖黃莖基部出現(xiàn)發(fā)病癥狀時，剪取新鮮葉片用于差異蛋白分析，接菌后5、10、15、20 d 調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù)。

1.2.2 差異表達(dá)蛋白分析 將新鮮煙葉樣品用酚抽提法提取蛋白，用裂解液溶解蛋白后再進(jìn)行超聲裂解，蛋白裂解液用DTT 還原處理后進(jìn)行半胱氨酸的烷基化封閉，再加入丙酮-20℃過夜沉淀蛋白，蛋白沉淀在TEAB 中再次超聲裂解后取上清用于定量。定量的蛋白加入胰蛋白酶消化后真空離心干燥，進(jìn)行iRATQ 標(biāo)記，每組樣品對應(yīng)一個分子質(zhì)量（iTRAQ113-大葉密合接種后、iTRAQ114-大葉密合接種前）。標(biāo)記后各組肽段混合，用SCX 進(jìn)行液相分離，MS/MS 鑒定。每個樣本設(shè)定兩次上機(jī)重復(fù)。蛋白鑒定結(jié)果 經(jīng)MASCOTT2.2 搜索Nicotiana benthamiana、Nicotiana sylvestris、Nicotiana tabacum等3 個 物種的整合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計分析，當(dāng)?shù)鞍棕S度比（即差異倍數(shù)）達(dá)到1.5 倍以上且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其P值小于0.05 時，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白，差異蛋白進(jìn)行GO 分析和Pathway 富集分析。

1.2.3 煙草凝集素基因轉(zhuǎn)錄水平分析 采用Trizol法提取新鮮煙草葉片RNA，采用微量紫外分光光度計測定RNA 濃度，采用瓊脂糖電泳技術(shù)測定RNA純度和完整度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen 公司）進(jìn)行cDNA 合成，反轉(zhuǎn)錄引物混合使用隨機(jī)引物和Oligo（dT）。使 用Fast SYBR?Green Master Mix Bulk Pack 試劑盒公司熒光定量擴(kuò)增煙草凝集素基因Nictaba，以actin為內(nèi)參。actin引物序列：actinf：5′-AAGGGATGCGAGGATGGA-3′；actinr：5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′，Nictaba引物序列：Nictabaf：5′-AGGGTAGCTTGGCTTGAC-3′；nictabar：5′-TCTTAGCGATGCTGTGGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳確認(rèn)。以2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情指數(shù)分析

由表1 可知，接入高致病力菌株203（生化型Ⅲ）后，感病對照品種長脖黃最先出現(xiàn)植株枯萎癥狀，抗病對照品種D101 于接菌后5 d 出現(xiàn)植株枯萎癥狀，大葉密合于接菌后10 d 出現(xiàn)植株枯萎癥狀。大葉密合的青枯病抗性表現(xiàn)優(yōu)于抗病對照品種D101。參試品種接入低致病力菌株204（生化型亞型Ⅲ-1），植株發(fā)病程度有所減緩，這與菌株致病力高度相關(guān)。接菌處理20 d 后，參試品種發(fā)病率均達(dá)75%以上，感病對照品種長脖黃發(fā)病率接近100%。

表1 參試品種接種青枯病菌后發(fā)病情況Table 1 Incidence of tested varieties after inoculation with Ralstonia solanacearum

2.2 蛋白質(zhì)信息鑒定

由圖1 可知，成功鑒定的有定量信息的蛋白共有1 312 個，其中共有蛋白1 277 個。GO 注釋包含描述基因的分子功能（Molecular function）、所處的細(xì)胞位置（Cellular component）、參與的生物過程（Biological process）。對總蛋白進(jìn)行GO注釋，鑒定到的蛋白在生物過程中占比較大條目為代謝過程（Metabolic process，26.55%）和細(xì)胞過程（Cellular process，24.09%），在分子功能中催化（Catalytic，41.03%）和結(jié)合（Binding，46.4%）占多數(shù)，而細(xì)胞組分中主要條目為細(xì)胞（Cell，25.51%）和細(xì)胞部分（Cell part，25.51%）。

圖1 GO 注釋分析Fig.1 GO annotation analysis

2.3 COG 功能分析

蛋白相鄰類的聚簇（Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG）是對蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。構(gòu)成每個COG 的蛋白均被假定為來自同一個祖先蛋白，且為Orthologs 或Paralogs。Orthologs 指來自于不同物種的由垂直家系（物種形成）進(jìn)化而來的蛋白，且特異地保留與原始蛋白相同的功能。Paralogs 指在一定物種中的來源于基因復(fù)制的蛋白，可能會進(jìn)化出新的與原來有關(guān)的功能。對鑒定蛋白進(jìn)行分類，翻譯后的修飾、蛋白周轉(zhuǎn)、分子伴侶（Posttranslational modification,protein turnover,chaperones）蛋白數(shù)量最多，其次是整體功能類（General function prediction only），RNA 加工與修飾類（RNA processing and modification）數(shù)量最少，具體如圖2 所示。

圖2 表達(dá)蛋白COG 功能分類Fig.2 Classification of COG function of expressed proteins

2.4 接種青枯病菌后差異表達(dá)蛋白分析

通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，對比接種青枯病菌前后的煙草葉片蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)35 個差異表達(dá)蛋白，其中21 個下調(diào)表達(dá)、14 個上調(diào)表達(dá)，共有25 個蛋白參與到植物應(yīng)對外界刺激反應(yīng)過程中（表2）。上調(diào)程度最大的蛋白為Hav1，屬于煙草凝集素家族?，F(xiàn)已在普通煙草不同品種中發(fā)現(xiàn)Hav1 的同源基因有sam1、sam2、sam3、sam4、hav1、hav2、wis、xan和by-2。這些凝集素基因高度保守，由165 個氨基酸編碼的蛋白在7 類氨基酸的位置上有差異。

表2 利用iTRAQ 技術(shù)在煙草葉片中鑒定到的差異表達(dá)蛋白Table 2 Differentially expressed proteins in tobacco leaves identified by iTRAQ

2.5 接種青枯病菌后煙草凝集素表達(dá)量變化

以煙草actin為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR 檢測煙草凝集素基因在抗病和感病兩個煙草品種分別接種致病和低致病青枯病菌后的相對表達(dá)量。由于煙草凝集素家族基因的高度保守性，擴(kuò)增片段包括該家族中的所有基因。接種致病與非致病青枯病菌后煙草凝集素在兩個煙草品種中的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖3），其中大葉密合煙草凝集素表達(dá)量的上升程度較長脖黃更高。長脖黃煙草凝集素的表達(dá)量在接種非致病菌后6 h 達(dá)到最高值，其余處理煙草凝集素表達(dá)量均在接菌后9 h 達(dá)到最高，接菌后12 h 的表達(dá)量較接菌后6 h 和9 h 下降。

圖3 參試品種接種青枯病菌后煙草凝集素的表達(dá)量Fig.3 Expression of nictaba in tested varietiesafter inoculation with Ralstonia solanacearum

3 討論

植物免疫激活的兩個平行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一位于葉綠體。葉綠體介導(dǎo)的免疫信號傳導(dǎo)會導(dǎo)致葉綠體源的活性氧（ROS）及抵御相關(guān)激素（如水楊酸SA、茉莉酸JA）的產(chǎn)生［16］。植物受到脅迫的反應(yīng)之一是生成ROS，但是大量ROS會損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此ROS 的生成和代謝需要依靠氧化還原反應(yīng)維持在穩(wěn)定狀態(tài)。本研究在抗性品種大葉密合中鑒定到在氧化還原平衡調(diào)控中起重要作用的5 個蛋白，包括多酚氧化酶、過氧化物酶、α 雙加氧酶和2 個硫氧還原蛋白。位于葉綠體中的6 個蛋白在接菌前后發(fā)生差異表達(dá)：2個硫氧還原蛋白、類囊體腔15 ku 蛋白及丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）表達(dá)量降低，5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶和光合系統(tǒng)Ⅰ亞基Ⅶ蛋白表達(dá)量升高。由于光合系統(tǒng)的蛋白通常協(xié)同表達(dá)，呈現(xiàn)相似的表達(dá)趨勢。Cheng 等［17］發(fā)現(xiàn)野火病菌（Pseudomonas syringaepv.tabaci）感染后煙草光合系統(tǒng)Ⅰ的活性下降，同時PsbO 蛋白、D1 蛋白和PsaA 蛋白發(fā)生降解。沈喜等［18］調(diào)查抗病品種小麥感染條銹病菌后葉綠素含量在0～12 d 內(nèi)的變化，發(fā)現(xiàn)葉綠素在0～3 d 下降，之后呈上升趨勢。葉綠體中的PPDK 在接菌后表達(dá)量下降，該酶也在光合作用中發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)該酶活性在煙草受到馬鈴薯病毒Y 侵染或干旱脅迫時提高。酶活性受翻譯后加工的影響，并不一定與酶的豐度直接相關(guān)［19］。由于植物受病菌感染后，參與免疫反應(yīng)的蛋白和RNA 的表達(dá)量也處于動態(tài)變化中，取樣時機(jī)對差異蛋白的鑒定及表達(dá)豐度有較大影響。茉莉酸及其衍生物在植物多個生物過程尤其是生物脅迫（如病原菌入侵、咀嚼式口器昆蟲取食）中發(fā)揮作用［20-21］。本研究鑒定到的差異蛋白中上調(diào)幅度最大的是凝集素家族成員之一的Hav1。凝集素廣泛存在于動物、植物和微生物中，具有至少1 個可以可逆結(jié)合特定單糖或寡糖的非催化結(jié)構(gòu)域［22］。凝集素蛋白由于具有細(xì)胞與蛋白或細(xì)胞與細(xì)胞之間的識別特性而參與到多種生物過程中，尤其是在免疫防御中發(fā)揮作用［23-24］。本研究調(diào)查了煙草凝集素在參試品種接菌后0～12 h 的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)煙草凝集素在接菌處理后9 h達(dá)到最高值后開始下降。斜紋夜蛾幼蟲對煙草的取食實驗表明，煙草凝集素的RNA 在取食10 h后表達(dá)量最高，之后略有下降，而蛋白表達(dá)量從開始取食后逐步升高，到取食后15 h 達(dá)到峰值，之后維持該水平到36 h 調(diào)查結(jié)束［25-26］，該研究中煙草凝集素的RNA 隨時間變化趨勢與本研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

廣東晾曬煙品種大葉密合具有良好的青枯病抗性。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，青枯病菌接種后大葉密合21 個蛋白表達(dá)量下調(diào)，14 個蛋白表達(dá)量上調(diào)。其中煙草凝集素蛋白Hav1上調(diào)表達(dá)量最大，煙草凝集素的轉(zhuǎn)錄在接菌后6 h和9 h達(dá)到最高值。鑒定到的差異蛋白中，上調(diào)幅度最大的是凝集素家族成員之一的Hav1，接種強(qiáng)致病力和無致病力菌株后煙草凝集素呈現(xiàn)類似的表達(dá)模式，表明凝集素蛋白可能在對病菌入侵后的上游反應(yīng)過程中發(fā)揮作用。