梅 瑜，徐世強(qiáng)，顧 艷，孫銘陽，周 芳，李靜宇，張聞婷，王繼華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省道地南藥資源保護(hù)與利用工程中心，廣東 廣州 510640）

【研究意義】藥用植物遺傳資源是優(yōu)良品種選育的基礎(chǔ)。近年來隨著市場(chǎng)需求的增長(zhǎng)，導(dǎo)致野生資源枯竭、馴化栽培品種品質(zhì)參差不齊。利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠精準(zhǔn)評(píng)價(jià)藥用資源，解析其藥用活性的合成途徑和調(diào)控機(jī)制，有利于藥用資源的保護(hù)和利用。【前人研究進(jìn)展】艾蒿（Artemisia argyi），是菊科蒿屬植物，多年生草本或略呈半灌木狀，具濃烈香氣，全草入藥，有溫經(jīng)、祛濕、散寒、止血、安胎、通經(jīng)活絡(luò)等功效。艾蒿中的揮發(fā)油類［1］、黃酮類、萜類、生物堿類、多糖類［2］等天然化學(xué)產(chǎn)物和大量微量元素［3］，具有鎮(zhèn)咳平喘、殺菌消炎、益氣活血、溫經(jīng)活絡(luò)、抗氧化等功效［4］，艾灸具有增強(qiáng)免疫力和抗炎作用。其黃酮的主要成分包括甲基黃酮類、槲皮素和柚皮素等［5］。胡倩等［6］利用AB-8 型大孔樹脂分離純化了艾葉總黃酮提取物（TFEFAA），采用HPLC分析獲得TFEFAA 的主要成分為棕矢車菊素和異澤蘭黃素，雖然其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別只有0.6%和0.20%，但能顯著增加SOD 酶、GSHPx 酶活力，且降低MDA 含量，能有效清除自由基和提高機(jī)體抗氧化能力。艾蒿還可作為天然的殺蟲劑、植物染料和飼料添加劑。艾蒿藥用功能顯著、價(jià)格低廉，因此在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域被廣泛利用，也受到學(xué)者們青睞。艾蒿品種較多，分布較為廣泛，藥用歷史悠久。梅全喜［7］記載艾蒿20 多種，紅足蒿（紅腳艾）是其中之一。三元宮碑文記載，1600 年前葛洪、鮑菇夫婦在羅浮山用紅腳艾為當(dāng)?shù)匕傩罩尾?，因此羅浮山紅腳艾在嶺南地區(qū)較有代表性，又稱“紅艾”“鮑姑艾”，別名神艾，與北艾、蘄艾同屬于菊科蒿屬艾草種植物。嶺南紅腳艾為菊科紅足蒿（Artemisia rubripesNakai），生長(zhǎng)在陽光充足的田野，莖枝呈紫紅色，多有橫臥地下根狀莖伴匍匐生長(zhǎng)，植株最高1 m 左右，香氣醇厚，基本為野生。紅腳艾常用于艾灸，是臨床應(yīng)用艾葉的來源之一。其蛋白質(zhì)中含有16 種常見氨基酸，7 種為必需氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的40.97%，功能性氨基酸占總氨基酸的53.6%，且葉小絨少，味略苦（其他品系艾草較苦）［8］，因此廣東當(dāng)?shù)厝顺⒓t腳艾用作主要的食材原料之一。【本研究切入點(diǎn)】目前，艾蒿的研究多集中于化學(xué)成分的分離鑒定、提取工藝優(yōu)化，以及藥理作用研究，而紅腳艾相關(guān)研究較少，尤其對(duì)紅腳艾組學(xué)研究和次生代謝產(chǎn)物合成途徑解析及化合物合成關(guān)鍵基因鑒定等未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】由于紅腳艾基因組信息缺乏，本研究利用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq 2500，選擇紅腳艾不同組織進(jìn)行混合DNA 池測(cè)序，通過Trinity 軟件de novo 組裝獲得紅腳艾轉(zhuǎn)錄組Unigene 庫，并基于公共數(shù)據(jù)庫對(duì)Unigene 進(jìn)行功能注釋，為后續(xù)的次生代謝產(chǎn)物合成途徑研究、相關(guān)功能基因挖掘及驗(yàn)證提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料紅腳艾蒿（A.rubripesNakai）種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所南藥資源圃，由王繼華研究員鑒定。選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的健康植株，采摘葉片，用錫箔紙包裹迅速置于液氮中。

1.2 紅腳艾RNA 的提取

紅腳艾總RNA 采用生工生物Total RNA Extractor kit（B511311-0025）進(jìn)行提取，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA 的完整性，用Qubit?2.0熒光計(jì)Life Tech（Invitrogen）對(duì)總RNA 進(jìn)行定量。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與功能注釋

紅腳艾RNA 樣品檢測(cè)合格后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。利用Illumina?NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit 制備測(cè)序文庫，之后使用Agilent Bioanalyzer 2100 評(píng)估文庫質(zhì)量；構(gòu)建合格文庫后，利用Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，獲得雙端測(cè)序數(shù)據(jù)；過濾原始數(shù)據(jù)中的接頭、低質(zhì)量（reads≤35 nt）和ploy-N 堿基的序列，獲得clean data，計(jì)算GC、Q20、Q30 含量及序列重復(fù)水平；采用Trinity 軟件進(jìn)行de novo 拼接組裝，用RSeQC 軟件去除冗余序列獲得Unigene,并評(píng)估基因表達(dá)水平［9-10］。利用BLAST 軟件［11］，基于NR、GO、COG、KOG、KEGG 等數(shù)據(jù)庫［12-18］對(duì)組裝的Unigene 進(jìn)行功能注釋。

1.4 SSR 鑒定及分析

使用MISA 微衛(wèi)星識(shí)別工具鑒定簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅腳艾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

利用Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)對(duì)紅腳艾RNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，去掉含有接頭和低質(zhì)量的序列，共得到7.24 Gb clean data，24 126 043 條reads，GC 含量為44.67%，各樣品Q30 堿基百分比均不小于92.57%，說明文庫構(gòu)建質(zhì)量良好，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。經(jīng)de novo 組裝，共得到173 093個(gè)轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為891.24 bp，N50 為1 406 bp，序列長(zhǎng)度大于500 bp 的有96 861 個(gè)，占總序列數(shù)目的55.96%；轉(zhuǎn)錄本去冗余后得到85 991 個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度為616.87 bp，N50 為925 bp，其中30 533 個(gè)（35.51%）序列長(zhǎng)度大于500 bp，有14 408 個(gè)（16.75%）序列長(zhǎng)度在1 000 bp 以上（表1）。

表1 紅腳艾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of transcriptome sequencing results of Artemisia rubripes Nakai

2.2 Unigene 功能注釋

通過BLAST軟件將獲得的85 991個(gè)Unigene序列與不同功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共注釋到47 216個(gè)（54.91%）Unigene（表2）。其中，NR數(shù)據(jù)庫（40 802個(gè)，47.45%）、KOG數(shù)據(jù)庫（26 171個(gè)，30.43%）、GO數(shù)據(jù)庫（23 203個(gè)，26.98%）和KEGG數(shù)據(jù)庫（16 846個(gè)，19.59%），COG數(shù)據(jù)庫注釋到的Unigene數(shù)量最少（12 810個(gè)，14.9%）。

表2 Unigene 的功能注釋統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of functional annotation of Unigene

2.2.1 NR 功能注釋 NR 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，紅腳艾與向日葵（Helianthus annuus）的單基因匹配率（13 552 個(gè)，15.76%）最高，其次是萵苣（Lactuca sativa，9 187 個(gè)，10.68%）、洋薊（Cynara cardunculusvar.scolymus，6 609 個(gè)，7.69%），與菊花（Chrysanthemum×morifolium）、莫氏黑粉菌（Moesziomyces antarcticusT-34）、青稞（Hordeum vulgaresubsp.Vulgare）的單基因匹配均小于400個(gè)?？梢?，紅腳艾與菊目菊科物種的相似度高。

2.2.2 GO 功能注釋 GO 注釋結(jié)果（圖1）顯示，紅腳艾有23 203 個(gè)Unigene 被歸為生物過程（43 283 個(gè)，50.33%）、細(xì)胞組成（47 818 個(gè)，55.79%）和分子功能（27 375 個(gè)，31.83%）三大類共51 個(gè)功能分類。在分子功能中，催化活性（12 156 個(gè)，14.14%）和結(jié)合（11 434 個(gè)，13.30%）注釋到的Unigene 較多；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞（9 631 個(gè)，11.20%）和細(xì)胞部分（9 607個(gè)，11.17%）注釋到的Unigene 較多；生物過程中，代謝過程（11 847 個(gè)，13.78%）和分子過程（10 948 個(gè)，12.73%）注釋最豐富。

圖1 紅腳艾Unigene 的GO 功能分類Fig.1 Classification of GO function of Artemisia rubripes Nakai Unigene

2.2.3 KEGG代謝通路分析 從KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果來看，16 846 個(gè)Unigene 參與到130 條代謝途徑中。其中核糖體途徑注釋的基因較豐富（824 個(gè)，4.89%），其次是碳代謝（604 個(gè)，3.59%）、剪切體（503 個(gè)，2.99%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工（474個(gè)，2.81%）和氨基酸生物合成（466 個(gè)，2.77%）等。參與類黃酮生物合成的基因有49 個(gè)，僅占0.29%。萜類作為自然界中結(jié)構(gòu)多、種類多的天然化合物，其生物合成分為前體合成、骨架構(gòu)建和后修飾3 部分。本研究獲得萜類骨架合成過程Unigene 105 個(gè)，參與直接前體GPP（Geranyl-PP）、IPP（Isopentenyl-PP）及DMAPP（Dimethylallyl-PP）的形成，參與單萜生物合成相關(guān)的Unigene 有13個(gè)，參與二萜生物合成的Unigene 有27 個(gè)，參與倍半萜和三萜生物合成相關(guān)的Unigene 有14 個(gè)，萜類經(jīng)細(xì)胞色素P450 等酶修飾后形成化合物，如二萜類化合物對(duì)腫瘤有一定治療作用，二萜類激素Gas 對(duì)植物發(fā)育具有調(diào)控作用，三萜皂苷具有很高的藥用價(jià)值等。

2.2.4 KOG 功能分類 KOG 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果（圖2）顯示，紅腳艾26 171 個(gè)Unigene 被注釋到25個(gè)KOG 功能分類中。其中，一般功能預(yù)測(cè)的基因最多，共有5 458 個(gè)，占20.86%；其次是信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)基因（2 976 個(gè)，11.37%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶基因（2 862 個(gè)，10.94%），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生相關(guān)基因（1 690 個(gè)，6.46%），轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因（1 527 個(gè)，5.83%），細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（1 374個(gè)，5.25%），碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因（1 319 個(gè)，5.04%），與次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝相關(guān)基因（1 164 個(gè)，4.45%）等，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)注釋到的基因最少，僅18 個(gè)，占0.07%；未知功能的基因有1 491 個(gè)，需在后期挖掘其功能。

圖2 紅腳艾Unigene 的KOG 功能分類Fig.2 Classification of KOG function of Artemisia rubripes Nakai Unigene

2.2.5 COG 功能注釋 COG 數(shù)據(jù)庫功能注釋結(jié)果（圖3）形式，共有12 810 個(gè)Unigene 被注釋到25 個(gè)COG 功能分類中。其中，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生的基因最多，有1 525 個(gè)，占11.9%；其次是一般功能預(yù)測(cè)基因（1 515 個(gè)，11.83%），翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、伴侶基因（1 287 個(gè)，10.05%），信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)基因（1 106 個(gè)，8.63%），碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因（1 098 個(gè)，8.57%）等；注釋基因最少的是RNA 加工與修飾，僅13 個(gè)，占0.1%；另有277 個(gè)Unigene 被注釋到未知功能基因，762 個(gè)Unigene 與次生代謝生物合成、運(yùn)輸和分解代謝相關(guān)，占5.95%。

圖3 紅腳艾Unigene 的COG 功能分類Fig.3 Classification of COG function of Artemisia rubripes Nakai Unigene

2.3 SSR 分布

利用MISA 軟件篩選得到10 00 bp 以上的紅腳艾Unigene 并進(jìn)行SSR 分析，結(jié)果（圖4）鑒定出6 種類型、3 529 個(gè)SSR 標(biāo)記。其中，單堿基重復(fù)SSR（p1）最多，共檢測(cè)到1 684 個(gè)位點(diǎn)；其次是三堿基重復(fù)SSR（p3）共檢測(cè)到1 017 個(gè)，雙堿基重復(fù)SSR（p2）有539 個(gè)，復(fù)合型重復(fù)SSR（c）有232 個(gè)，四堿基重復(fù)SSR（p4）有37個(gè)，五堿基重復(fù)SSR（p5）和六堿基重復(fù)SSR（p6）較少，分別為5 個(gè)和11 個(gè)。

圖4 紅腳艾Unigene 的SSR 位點(diǎn)分析Fig.4 SSR sites analysis of Artemisia rubripes Nakai Unigene

3 討論

紅腳艾歷史上主要分布于嶺南地區(qū)，惠州市的博羅縣、羅浮山及廣州市番禺區(qū)等地皆有縣志及通史記載，但近代以來對(duì)其研究與利用很少。隨著本草組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多藥用植物基因組得到解析，也使得很多資源得以利用和保護(hù)［19］。由于藥用植物基因組學(xué)研究晚于大眾作物，因此轉(zhuǎn)錄組學(xué)成了本草基因組學(xué)研究的重要手段之一。本研究借助高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)紅腳艾轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了初步探究，共獲得7.24 Gb clean data，GC含量為44.67%，Q30堿基百分比達(dá)到92.57%以上；通過Trinity 進(jìn)行de novo 組裝，共得到173 093 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，對(duì)組裝的轉(zhuǎn)錄本去冗余后共獲得85 991個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度為616.87 bp，N50 為925 bp，說明紅腳艾的組裝質(zhì)量較好，能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的要求。

通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)，注釋到47 216 個(gè)Unigene，與向日葵（H.annuus）、萵苣（L.sativa）、洋薊（C.cardunculusvar.scolymus）等菊科植物匹配基因最多，另有45.09%的Unigene 未被注釋，可能由于蒿屬植物組學(xué)報(bào)道較少或組裝的序列較短等原因?qū)е拢?0］。在KEGG 代謝通路分析中，核糖體途徑、蛋白質(zhì)加工、氨基酸生物合成途徑注釋的基因較豐富，可能與氨基酸種類、總氨基酸含量較高有關(guān)，而參與類黃酮生物合成的基因有49 個(gè)，僅占0.29%，這可能是紅腳艾側(cè)柏酮含量極低的原因。本研究結(jié)果可為紅腳艾功能基因挖掘、次級(jí)代謝物質(zhì)合成通路解析提供幫助，也可為中藥指紋圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源鑒定保存及分子輔助良種選育提供基礎(chǔ)［21］。

SSR 分子標(biāo)記具有豐度高、共顯性和多等位性等優(yōu)點(diǎn)［22］，可利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫資源開發(fā)SSR 引物。本研究鑒定到紅腳艾SSR 位點(diǎn)3 529 個(gè)，可為其分子標(biāo)記開發(fā)、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定與優(yōu)選、分子標(biāo)記育種等奠定理論基礎(chǔ)，為利用分子手段鑒定、區(qū)分紅腳艾品種及評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)獲得了紅腳艾的轉(zhuǎn)錄組信息特征，經(jīng)de novo 組裝共獲得85 991個(gè)Unigene，有47 216 個(gè)Unigene 在NR、KEGG、COG、KOG、GO 和Pfam 數(shù)據(jù)庫獲得功能注釋。KEGG 代謝通路中，有16 846 個(gè)Unigene 參與氨基酸、萜類、黃酮類等130 條代謝途徑，其中有466 個(gè)Unigene 參與氨基酸合成、49 個(gè)Unigene 參與黃酮類合成。同時(shí)在紅腳艾中還鑒定到3 529 個(gè)SSR 標(biāo)記，通過獲得的紅腳艾遺傳標(biāo)記位點(diǎn)分布和Unigene，可進(jìn)行SSR 引物設(shè)計(jì)，為紅腳艾種質(zhì)資源遺傳改良、分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。