唐順利，李明麗，王孝義，蘭國湘，張燕林，計春律，陳 強，魯紹雄

（1.云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南福悅發(fā)畜禽養(yǎng)殖有限公司，云南 昆明 650300）

母豬繁殖性狀是養(yǎng)豬生產中最重要的經濟性狀之一，對豬群生產效率和效益有著十分重要的影響[1]。提高母豬繁殖性能一直是豬育種工作的重要目標，但由于豬繁殖性狀的遺傳力普遍較低（如產仔數平均遺傳力僅約0.1）[2]，且測定周期較長，常規(guī)育種的選擇難度大，改良進展甚微。得益于DNA 標記技術的迅猛發(fā)展，特別是部分豬種全基因組測序的完成[3-4]，加速了全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）的應用，相繼發(fā)掘了一批可能影響豬繁殖性狀的SNP、QTL 和候選基因[5-10]，為應用基因輔助選擇（geneassisted selection，GAS）乃至全基因組選擇（genomic selection，GS）加快豬育種進程提供了更加高效的路徑。陳強[11]基于簡化基因組測序（GGRS）平臺聯合GWAS 方法對初產母豬總產仔數的遺傳機制進行了研究，篩選出與繁殖性狀相關的候選基因-絲氨酸/蘇氨酸激酶32B（serine/threonine kinase 32B，STK32B）基因。

STK32B 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Ser/Thr protein kinase，Ser/Thr PK）家族成員，能特異性地催化蛋白質絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，在細胞分裂、增殖、凋亡和分化等細胞活動中起關鍵作用[12-14]。有報道顯示：STK32B基因參與了抑制非絨毛外滋養(yǎng)細胞HLA-G 表達[15]，與人的妊娠并發(fā)癥顯著關聯[16]。張丹[17]報道：STK32B基因可能與大鼠宮內生長遲緩有關；祁云霞[18]和付紹印等[19]對羊的研究結果顯示：STK32B基因的表達水平與母羊排卵和卵泡發(fā)育關聯。這些結果提示：STK32B基因對人與動物的妊娠及胚胎發(fā)育過程具有一定調控作用，推斷其可能與家畜繁殖性狀存在某種關聯。

豬STK32B基因位于8 號染色體，全長361.51 kb，包含12 個外顯子，編碼區(qū)長3 247 bp，編碼414 個氨基酸。有研究顯示：豬的8 號染色體上存在著顯著影響黃體數、產仔數和乳頭數等繁殖性狀的QTL[20-21]，GWAS 研究[22-23]也證實了這一結果。盧圣菲[24]的研究表明：STK32B基因是高產仔與低產仔組香豬特有的結構變異編碼基因之一。基于STK32B 的功能和已有研究結果，初步推斷STK32B基因可能對母豬繁殖性狀有一定影響，但迄今為止仍缺乏直接的研究報道。

有鑒于此，本研究以STK32B作為大白豬繁殖性狀的候選基因，在對其外顯子8 區(qū)域SNP 位點進行檢測的基礎上，分析該基因外顯子8 多態(tài)性及各變異位點與繁殖性狀的關聯，以初步揭示該基因對母豬繁殖性狀的影響及效應，為在實際育種工作中利用STK32B基因標記改良豬繁殖性能提供一定的基礎與依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究所用的476 頭大白豬（母豬433 頭，公豬43 頭）耳組織樣品均采自云南福悅發(fā)畜禽養(yǎng)殖有限公司原種豬場。豬群系譜清楚、體況良好、繁殖正常，飼料營養(yǎng)與飼養(yǎng)管理條件一致。每頭豬采集約2 g 耳組織樣品，裝入盛有75%乙醇的凍存管內，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 繁殖性能測定

本研究持續(xù)跟蹤測定433 頭母豬共2 177 窩的繁殖性能，包括總產仔數、產活仔數、初生窩質量、21 日齡斷奶仔豬數和21 日齡斷奶窩質量共5 個性狀。豬群性能測定參照文獻[25]在云南福悅發(fā)畜禽養(yǎng)殖有限公司原種豬場完成。

1.3 STK32B 基因多態(tài)性檢測

1.3.1 基因組DNA 提取

利用動物基因組DNA 提取試劑盒（TSINGK E）提取耳組織樣品基因組DNA，并置于-20 ℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設計與合成

根據Ensemble 數據庫（http://asia.ensembl.org/index.html）中豬STK32B基因第8 外顯子序列，利用Primer Premier 5.0 軟件[26]設計1 對引物。正向引物F：5′-GCATCTGCTCATCCCAAACTCCC-3′，反向引物R：5′-CTGCCTGATCCTGCACCGAGA-3′，預期擴增片段長度為312 bp。引物委托北京擎科（昆明）生物技術有限公司合成。新合成的引物稀釋至10 μmol/L，經混勻和離心，待其充分溶解后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR 反應體系及反應條件

PCR 擴增反應總體積為25 μL，包括2×PCR mix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，正、反向引物各0.5 μL，加ddH2O 補足至25 μL。反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)，72 ℃再延伸8 min，最后4 ℃保存。PCR 產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 目的片段測序與基因分型

經檢測合格的PCR 擴增產物送至北京擎科（昆明）生物技術有限公司進行測序。測序結果利用BioEdit v7.0.9 軟件進行序列比對，結合序列峰圖找出多態(tài)位點。各SNP 的位置及基因型按其CDS 序列及相應堿基名稱進行命名。

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 基因型與基因頻率計算

根據STK32B基因分型結果，統(tǒng)計各位點不同基因型個體數，據此計算出基因型頻率、基因頻率、多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）及雜合度（heterozygoisity，H），各位點的Hardy-Weinberg 平衡檢驗采用χ2檢驗進行。

1.4.2 單倍型分析

采用Phase 2.0 軟件對STK32B基因各SNP 位點進行單倍型（haplotype）分析，獲得單倍型和單倍型組合（haplotype combination）及其相應頻率。

1.4.3 不同基因型與單倍型組合性狀差異分析

STK32B基因單個SNP 位點不同基因型和3 個SNP 位點不同單倍型組合的繁殖性狀差異分別采用模型1 和模型2 進行分析。

模型中：Yijklm和Yijk為性狀觀察值；μ為群體均值；SNP1i、SNP2j和SNP3k為3 個SNP 位點的基因型效應；PARITYl和PARITYj為分娩胎次效應；eijklm和eijk為隨機誤差效應。

根據上述模型，采用SAS 9.2 的GLM 過程[27]分析各SNP 位點不同基因型（或單倍型組合）的繁殖性狀的差異，結果以“最小二乘均數±標準誤”表示。差異顯著性判斷標準P=0.05 和P=0.01。

2 結果與分析

2.1 目的片段擴增與SNP 位點檢測

所擴增的STK32B基因片段（圖1）條帶單一，大?。?12 bp）符合預期，滿足DNA 測序要求。

圖1 大白豬STK32B 基因PCR 結果Fig.1 PCR results of STK32B gene of Large White pigs

PCR 產物測序結果顯示：在STK32B基因第8外顯子上檢出3 個SNP 位點，即CDS 669 bp 處A→G（A669G）和CDS 732 bp 處C→T（C732T），均為同義突變（圖2、3）；CDS 749 bp 處C→T（C749T）為錯義突變（圖4），導致其編碼的蘇氨酸（Thr）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕et）。其中，A669G 位點只檢出AA 和AG 2 種基因型，C732T 及C749T 位點均檢出CC、CT 和TT 3 種基因型。

圖2 STK32B 基因擴增序列中的A669G 位點Fig.2 Locus A669G in the amplified sequence of STK32B gene

圖3 STK32B 基因擴增序列中的C732T 位點Fig.3 Locus C732T in the amplified sequence of STK32B gene

圖4 STK32B 基因擴增序列中的C749T 位點Fig.4 Locus C749T in the amplified sequence of STK32B gene

2.2 基因型頻率與基因頻率

由表1 可知：大白豬STK32B基因第8 外顯子3 個SNP 位點的基因型和基因頻率呈現較為一致的規(guī)律，A669G、C732T 和C749T 位點分別以AA、CC 和CC 基因型頻率最高，GG、TT 和TT 基因型頻率最低；高頻等位基因分別為A、C和C；3 個位點均呈低度多態(tài)（PIC 分別為0.145 0、0.174 4 和0.170 3）且遺傳多樣性較低（H分別為0.157 4、0.193 0 和0.188 0）。除A669G 位點外，其余位點均處于遺傳平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表1 大白豬STK32B 基因各SNP 位點的基因型及基因頻率Tab.1 Genotypic and allelic frequencies at SNPs of STK32B gene in Large White pigs

2.3 三位點單倍型及其頻率

由表2 可知：大白豬STK32B基因第8 外顯子3 個SNP 位點共有5 種單倍型，分別為ACC、ACT、ATC、GCC 和GCT，其頻率分別為0.787 5、0.018 5、0.107 4、0.001 1 和0.085 5；共有8 種單倍型組合。各單倍型組合中，以ACC/ACC 組合頻率（0.614 3）最高，ACC/ATC（0.168 6）次 之，ACT/GCT 與ATC/GCC 頻率（0.002 3）最低且均只檢出1 個個體。

表2 大白豬STK32B 基因的單倍型及其組合頻率Tab.2 Frequencies of the haplotypes and their combinations of STK32B gene in Large White pigs

2.4 各位點不同基因型母豬的繁殖性狀差異

由表3 可知：大白豬STK32B基因A669G 位點AA 基因型母豬的仔豬初生窩質量顯著高于AG 基因型（P＜0.05）。C732T 位點母豬總產仔數以TT 基因型最高，且顯著高于CC 基因型（P＜0.05），但與CT 基因型差異不顯著（P＞0.05）；產活仔數和仔豬初生窩質量以CT 基因型最高，且顯著高于CC 和TT 基因型（P＜0.05）。C749T 位點TT 基因型母豬的仔豬初生窩質量最高，且顯著高于CC 基因型（P＜0.05），但與CT 基因型差異不顯著（P＞0.05）。各位點不同基因型在其他性狀上的差異均未達到顯著水平（P＞0.05）。

表3 大白母豬STK32B 基因各位點不同基因型的繁殖性狀Tab.3 Reproductive traits of different genotypes of each SNP of STK32B gene in Large White sows

2.5 不同單倍型組合母豬的繁殖性能差異

由于大白豬STK32B基因3 個SNP 位點ACT/GCT、ATC/ATC 和ATC/GCC 組合因檢出個體數過少，故未納入結果分析。由表4 可知：不同單倍型組合在所有性狀上都存在顯著差異（P＜0.05 或P＜0.01）。其中，總產仔數和產活仔數都以ACC/ATC 組合最高，分別以ATC/GCT 和ACC/ACC組合最低（P＜0.01）；仔豬初生窩質量和斷奶窩質量都以ACC/ACT 組合最高，分別以ACC/ACC和ACC/ATC 組合最低（P＜0.01，P＜0.05）；斷奶仔豬數以ACC/GCT 組合最高，以ATC/GCT 組合最低（P＜0.05）。同一單倍型組合對不同性狀的效應呈現一定的“拮抗”效應，如總產仔數和產活仔數的增效組合為ACC/ATC，其斷奶仔豬數和斷奶窩質量卻顯著低于最高的ACC/GCT 和ACC/ACT 組合（P＜0.05）。

表4 大白母豬STK32B 基因不同單倍型組合的繁殖性狀Tab.4 Reproductive traits of different haplotype combinations of STK32B gene in Large White sows

3 討論

3.1 大白豬STK32B 基因外顯子8 多態(tài)性

本研究表明：大白豬STK32B基因外顯子8 區(qū)域檢出的A669G、C732T 和C749T 位點基因頻率呈現一致的分布規(guī)律，分別以等位基因A、C 和C 的頻率最高，G、T 和T 的頻率最低。這可能是由于3 個位點與某些經濟性狀存在一定關聯，而豬群長期開展的持續(xù)選育使得與目標性狀關聯的等位基因頻率發(fā)生定向改變，這在后續(xù)的關聯分析結果中得到了一定印證。在3 個位點中，A669G 位點僅檢出AA 和AG 2 種基因型，其原因可能是由于GG 基因型頻率很低，而本研究的檢測樣本仍不夠大而導致GG 基因型未被檢出。在8 種單倍型中，ACC 單倍型的頻率高達0.787 5，顯示3 個位點呈緊密連鎖。事實上，3 個位點物理距離跨度僅81 bp，連鎖分析結果也顯示C749T 與C732T、A669G 位點的r2分別達1.00 和0.78（結果未列出），進一步證實3 個位點的緊密連鎖關系。

就本試驗豬群而言，STK32B基因3 個位點平均PIC 和H分別僅為0.163 2 和0.179 5，多態(tài)性和遺傳多樣性相對較低，這與豬群2013 年以來一直實行閉鎖繁育的實際相吻合，說明長期閉鎖已在一定程度上導致豬群趨同和遺傳多樣性下降，如能通過遺傳交流適量引入育種目標相近的種豬（特別是種公豬），對擴大群體內的遺傳變異，進而提升豬群的育種改良效果和性能水平具有積極意義。

3.2 STK32B 基因外顯子8 多態(tài)性對母豬繁殖性能的影響

關聯分析結果顯示：大白豬STK32B基因外顯子8 區(qū)域的A669G 和C749T 位點與仔豬初生窩質量、C732T 位點與總產仔數、產活仔數和仔豬初生窩質量均顯著關聯，其中A669G 位點的AA 基因型、C732T 位點的TT 和CT 基因型以及C749T 位點的TT 基因型為顯著關聯性狀的增效基因型。有觀點認為：在SNP 與性狀的關聯分析中，多位點單倍型分析較單位點分析更為有效[28]，這對于緊密連鎖的多個位點與多基因控制的復雜性狀而言顯得尤為重要。為此，本研究進一步分析了3 個位點不同單倍型組合的性狀差異，結果顯示：ACC/ATC 可顯著提高母豬的總產仔數和產活仔數，ACC/ACT 組合可顯著提高仔豬初生窩質量和斷奶窩質量，ACC/GCT 組合可顯著提高斷奶仔豬數。

基于STK32B 在細胞分裂、增殖和分化等過程中的關鍵性作用[14]、豬產仔數等繁殖性狀的QTL 定位[20-21]和GWAS 研究[11,22-23]以及人[16]、大鼠[17]和羊[18-19]等其他物種STK32B基因的相關研究報道，結合本研究結果，初步推斷STK32B基因與母豬繁殖性狀存在顯著關聯。然而，從各單倍型組合的繁殖性狀差異情況看，增效單倍型組合均攜帶ACC 單倍型，但ACC/ACC 組合卻未呈現顯著增效效應，即A669G、C732T和C749T 位點的A、C 和C 等位基因對母豬繁殖性狀雖有一定的增效效應，但各SNP 位點間卻存在一定的互作，從而導致同一單倍型組合對不同性狀的效應并不一致，呈現一定的性狀特異性。同時，由于本研究僅涉及第8 外顯子區(qū)域，加之迄今未見其他豬種STK32B基因多態(tài)性與繁殖性狀關聯的相關報道，有關該基因其他區(qū)域的SNP 變異位點、不同豬種STK32B基因多態(tài)性及其效應仍不得而知。如能增加研究豬群，并對STK32B基因其他區(qū)域的SNP 進行檢測與分析，將有助于更加深入地揭示該基因的多態(tài)性及其確切效應。

4 結論

大白豬STK32B基因外顯子8 區(qū)域共檢出3 個緊密連鎖的SNP 位點，平均PIC 和H分別為0.163 2 和0.179 5，提示長期閉鎖繁育已導致試驗豬群遺傳多樣性下降；STK32B基因外顯子8 多態(tài)性與大白母豬繁殖性狀顯著關聯，但3 個位點單倍型組合的效應具有一定的性狀特異性。