張龍飛，行倩文，沈 童，葉 靈，楊苑鶴，王夢杰，劉嘉華，吳 華

（青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

黑枸杞作為青藏高原特色野生植物，因含有豐富的花青素被譽(yù)為“花青素之王”。花青素又稱花色苷，主要存在于植物的果實(shí)、種子、花和果皮中，是一類在植物界中廣泛存在的類黃酮酚類化合物[1]。研究發(fā)現(xiàn)：青藏高原黑枸杞花青素具有抗炎、抗氧化和提高免疫力等多種生物功效[1-2]，可以提高人體免疫力、降血糖、降血脂和抗癌等，但基于細(xì)胞凋亡揭示其免疫功能的研究較少[1-3]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能中重要的組成部分，其主要功能是參與抗原處理、消滅各種病原微生物和抗腫瘤等?；诖?，本研究分析黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡的調(diào)節(jié)作用，以期為深入研究黑枸杞花青素對細(xì)胞水平的免疫功能機(jī)制提供理論參考，也為青藏高原黑枸杞花青素作為免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物及試劑

黑枸杞花青素（花青素64.40%，蛋白6.00%，糖1.32%，氨基酸3.56%，灰分0.60%，其他24.22%）購自青海金麥杞生物科技有限公司[3]；DMEM 干粉、胎牛血清和雙抗購自Gibco 公司；PBS購自Hfart公司；胰蛋白酶EDTA 溶液（0.25%）購自Solarbio 公司；臺盼藍(lán)購自江蘇碧云天；TRNzol Universal 總RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SuperReal 彩色熒光定量預(yù)混試劑盒購自天根生化科技有限公司；Caspase-3、Bax、Bcl-2和JNK引物購自上海生工；山羊抗IgG 和β-tubulin 購自Abcam 公司；Caspase-3 和Bcl-2 購自Biodragon 公司；p-JNK 抗體購自BOSTER 公司；Ant-GAPDH 購自Immunoway 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司；BD Pharmingen Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences（Franklin Lakes，NJ，美國）；DAPI 和Hoechst 染色試劑盒購自Solarbio 公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司。

1.1.3 儀器

超凈工作臺購自江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；臺式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱及CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國NUAIRE 公司；高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司；酶標(biāo)儀購自意大利MuLTISKAN 公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR 儀及熒光定量系統(tǒng)購自BIO-RAD；Western-blot 電泳設(shè)備購自北京六一生物科技公司；搖床購自美國SCILOGEX 公司；化學(xué)發(fā)光成像儀購自北京賽智科技有限公司；倒置熒光顯微鏡購自日本NIKON 公司；流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

黑枸杞花青素溶液的配制：取0.01 mg 黑枸杞花青素于DMEM 培養(yǎng)基中溶解，配成100 μg/mL的花青素母液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆茫籎NK抑制劑SP600125 溶液配制：取1 mg SP600125于DMEM 培養(yǎng)基中溶解，配成1 mmol/L 的SP-600125 母液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ū驹囼?yàn)SP600125 終濃度為10 μmol/L）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞懸液0.1 mL 于1.5 mL 離心管，加入PBS 0.8 mL 和0.4%臺盼藍(lán)染液0.1 mL，搖勻，室溫放置2～3 min 后置于血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理

細(xì)胞計數(shù)后，用DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋到1×106個，取24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞稀釋液500 μL，然后按分組加入花青素母液、SP600125 母液和DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整至相應(yīng)質(zhì)量濃度且每孔終體積為2 mL，每組3 個復(fù)孔，分組處理后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。①不同質(zhì)量濃度的花青素分組為：花青素0、12.5、25.0、50.0 和100.0 μg/mL 組；② JNK 抑制劑試驗(yàn)分組為（按照課題組前期試驗(yàn)篩選出的花青素最佳增殖質(zhì)量濃度為25.0 μg/ mL）：花青素0 μg/mL組、花青素25.0 μg/mL 組、SP600125 10 μmol/L組、花青素25.0 μg/mL+SP600125 10 μmol/L 組。

1.2.4 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 形態(tài)觀察

采用掃描電鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)。黑枸杞花青素25.0 μg/mL 作用24 h，用PBS 緩沖液洗滌2 次，每次5 min；倒入2.5%戊二醛固定液，4 ℃固定1 h 后用PBS 清洗；分別用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次脫水10 min，然后用液體CO2置換，冷凍干燥3 h后用離子濺射儀將樣本表面噴金90 s。掃描電鏡分別在樣本的5 個方位（前、后、左、右、中）進(jìn)行低倍至高倍觀察，并記錄圖片以供分析。

1.2.5 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 核形態(tài)觀察

以每孔4×104個細(xì)胞接種到24 孔培養(yǎng)板中，按1.2.3 節(jié)分組②處理，然后將細(xì)胞用1% PBS 洗滌2 次并用4%甲醛固定，加入DAPI 和Hoechst染液分別室溫孵育15 和30 min 后，再用1% PBS洗滌2 次，然后使用倒置熒光顯微鏡觀察。使用Nikon Eclipse Ti 熒光顯微鏡捕獲顯微照片，并使用 DS-Qi1 黑白相機(jī)拍照。

1.2.6 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡率檢測

以每孔5×106個小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 接種到24 孔培養(yǎng)板中，處理24 h 后收集細(xì)胞，冷PBS 洗滌2 次，懸浮于1×結(jié)合緩沖液 100 μL，AV-FITC 5 μL 及PI 10 μL 室溫避光染色15 min，然后加入1×結(jié)合緩沖液400 μL 后用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.7 RT-qPCR 檢測JNK 通路因子JNK及凋亡因子Caspase-3、Bax及Bcl-2mRNA 表達(dá)

用TRNzol 法分別提取各組細(xì)胞總RNA 并進(jìn)行完整性檢測及質(zhì)量濃度檢測，隨后按照天根公司的cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用SYBR PrimescriptTM試劑盒進(jìn)行定量PCR 分析。引物序列見表1。

表1 實(shí)時熒光定量引物Tab.1 Primer for RT-qPCR

1.2.8 Western-blot 檢測JNK 通路因子p-JNK 及凋亡因子Caspase-3 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)

分別提取各組細(xì)胞總蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度。使用SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜及封閉，配制及加入一抗（p-JNK 抗體、Bcl-2 抗體和Caspase-3 抗體等），4 ℃孵育過夜，加入山羊抗IgG 二抗，室溫孵育1 h后洗膜，在暗室顯影觀察，并定影。采用Image J對條帶吸光度值（OD 值）進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件 SPSS 21.0 進(jìn)行分析，應(yīng)用 one-way ANOVA 選擇Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著；采用GraphPad Prism8.0 繪圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞花青素對巨噬細(xì)胞RAW264.7 的影響

2.1.1 對RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖1 可知：25.0 μg/mL 黑枸杞花青素作用24 h 后，RAW264.7 細(xì)胞的形態(tài)完好，均表現(xiàn)出典型的RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)，即略呈三角形?；ㄇ嗨? 和25.0 μg/mL 組細(xì)胞在電鏡下的貼壁狀態(tài)良好，形態(tài)豐滿，細(xì)胞表面有細(xì)密的微絨毛，相鄰細(xì)胞間緊密相連；花青素25.0 μg/mL 組細(xì)胞數(shù)量明顯多于花青素0 μg/mL組。表明黑枸杞花青素誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 后，細(xì)胞形態(tài)正常，可促進(jìn)其增殖且未出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

圖1 不同質(zhì)量濃度黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 形態(tài)的影響Fig.1 Effect of different mass concentrations of black wolfberry anthocyanin on the morphology of mouse macrophages RAW264.7

2.1.2 對RAW264.7 細(xì)胞核形態(tài)的影響

由圖2 可知：花青素0 和25.0 μg/mL 組細(xì)胞均具有圓形的均質(zhì)核，沒有形態(tài)變化的單層細(xì)胞，未表現(xiàn)出典型的凋亡特征，且花青素25.0 μg/mL組細(xì)胞數(shù)量多于花青素0 μg/mL 組。表明黑枸杞花青素誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 24 h 可減少細(xì)胞凋亡，可能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖2 不同質(zhì)量濃度黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 核形態(tài)的影響Fig.2 Effect of different mass concentrations of black wolfberry anthocyanins on the nuclear morphology of mouse macrophages RAW264.7

2.1.3 對RAW264.7 細(xì)胞凋亡率的影響

由圖3 和表2 可知：各處理組細(xì)胞凋亡率均明顯低于花青素0 μg/mL 組，且呈劑量依賴性；花青素12.5 μg/mL 組凋亡率顯著降低（P＜0.05），花青素25.0、50.0 和100.0 μg/mL 組凋亡率極顯著降低（P＜0.01），說明黑枸杞花青素能抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡。

表2 不同質(zhì)量濃度黑枸杞花青素作用24 h 后小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 生存狀態(tài)百分率分析Tab.2 Percentage analysis of the survival status of mouse macrophages RAW264.7 after 24 hours of black wolfberry anthocyanins in different mass concentrations

圖3 不同質(zhì)量濃度黑枸杞花青素對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 凋亡率的影響Fig.3 Effect of different mass concentrations of black wolfberry anthocyanin on the apoptosis rate of mouse macrophages RAW264.7

2.1.4 對RAW264.7 RNA 完整性的影響

由圖4 可知：3 條光帶中，28S 條帶的亮度約為18S 條帶的2 倍，5S 條帶隱約可見，并且沒有出現(xiàn)DNA 雜帶以及向前拖尾現(xiàn)象，用核酸蛋白檢測儀檢測提取的總RNA 純度（OD260/OD280）均在1.8～2.0，且總RNA 的質(zhì)量濃度合理，說明RNA 樣品完整性較好，可以用于后期反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

圖4 RNA 電泳圖Fig.4 RNA electrophoresis

2.1.5 對RAW264.7 凋亡因子Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響

（1）對Bcl-2、Caspase-3和BaxmRNA 表達(dá)的影響

由圖5 可知：與花青素0 μg/mL 組相比，花青素25.0 μg/mL 組的Caspase-3和BaxmRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），花青素50.0 和100.0 μg/mL組的Caspase-3和BaxmRNA 表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）且呈劑量依賴性；與花青素0 μg/mL組相比，花青素12.5和25.0 μg/mL 組的Bcl-2mRNA表達(dá)量均顯著增高（P＜0.05），花青素50.0 和100.0 μg/mL 組的Bcl-2mRNA 表達(dá)量均極顯著增高（P＜0.01）且呈劑量依賴性；花青素12.5 μg/mL組能顯著降低Bax/Bcl-2表達(dá)量的值（P＜0.05），花青素25.0、50.0 和100.0 μg/mL 組能極顯著降低Bax/Bcl-2表達(dá)量的值（P＜0.01）。表明黑枸杞花青素可以通過降低Caspase-3和BaxmRNA 表達(dá)以及增高Bcl-2mRNA 表達(dá)抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW-264.7 凋亡。

圖5 黑枸杞花青素對Caspase-3、Bcl-2 和Bax mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of black wolfberry anthocyanin on the expression level of Caspase-3,Bcl-2 and Bax mRNA

（2）對Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

由圖6 可知：與花青素0 μg/mL 組相比，花青素12.5 μg/mL 組Caspase-3 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），花青素25.0、50.0 和100.0 μg/mL 組Caspase-3 表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）且呈劑量依賴性；花青素12.5 μg/mL 組Bcl-2 表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），花青素25.0、50.0 和100.0 μg/mL組Bcl-2 表達(dá)量均極顯著增高（P＜0.01）且呈劑量依賴性。表明黑枸杞花青素可通過降低Caspase-3 蛋白表達(dá)和增高Bcl-2 蛋白表達(dá)抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡。

圖6 黑枸杞花青素對Caspase-3 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of black wolfberry anthocyanin on the expression of Caspase-3 and Bcl-2 protein

2.1.6 對RAW264.7 JNK 信號通路因子JNK表達(dá)的影響

（1）對JNK因子mRNA 表達(dá)的影響

由圖7 可知：與花青素0 μg/mL 組相比，花青素25.0 μg/mL 組的JNKmRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）且呈劑量依賴性；花青素50.0 和100.0 μg/mL 組的JNKmRNA 表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）且呈劑量依賴性。表明黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡時可能與JNK通路調(diào)控有關(guān)。

圖7 黑枸杞花青素對JNK mRNA 表達(dá)的影響Fig.7 Effect of black wolfberry anthocyanins on the expression of JNK mRNA

（2）對p-JNK 蛋白表達(dá)的影響

由圖8 可知：與花青素0 μg/mL 組相比，花青素12.5 μg/mL 組的p-JNK 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），花青素25.0、50.0 和100.0 μg/mL 組的p-JNK 表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）且呈劑量依賴性。表明JNK 通路可能參與調(diào)控黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡。

圖8 黑枸杞花青素對p-JNK 蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of black wolfberry anthocyanin on the expression of p-JNK protein

2.2 黑枸杞花青素結(jié)合通路抑制劑SP600125 對巨噬細(xì)胞RAW264.7 的影響

2.2.1 對RAW264.7 細(xì)胞核形態(tài)的影響

由圖9 可知：各組細(xì)胞均具有圓形的均質(zhì)核，沒有形態(tài)變化的單層細(xì)胞，未表現(xiàn)出典型的凋亡特征，且花青素+SP600125 組細(xì)胞數(shù)量多于兩者單獨(dú)處理組。表明黑枸杞花青素與JNK 通路抑制劑SP600125 有協(xié)同抑制凋亡的作用，可能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖9 黑枸杞花青素結(jié)合SP600125 對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 核形態(tài)的影響Fig.9 Effect of black wolfberry anthocyanin combined with SP600125 on the nuclear morphology of mouse macrophages RAW264.7

2.2.2 對RAW264.7 凋亡率的影響

由圖10 和表3 可知：與花青素0 μg/mL 組相比，各組細(xì)胞凋亡率極顯著降低（P＜0.01 或P＜0.001）；與SP600125 10 μmol/L 組相比，花青素25.0 μg/mL 組的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），花青素結(jié)合SP600125 組的凋亡率極顯著降低（P＜0.001），表明黑枸杞花青素與JNK 通路抑制劑SP600125 有協(xié)同作用，可抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡。

表3 黑枸杞花青素(AC)結(jié)合通路抑制劑SP600125 對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 生存狀態(tài)百分率分析Tab.3 Analysis on the percentage of survival status of mouse macrophages RAW264.7 by SP600125,an inhibitor of black wolfberry（AC）anthocyanin binding pathway

圖10 黑枸杞花青素(AC)結(jié)合SP600125 對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 凋亡率的影響Fig.10 Effect of black wolfberry anthocyanin（AC）combined with SP600125 on the apoptosis rate of mouse macrophages RAW264.7

2.2.3 對RAW264.7 JNK 信號通路因子JNK表達(dá)的影響

（1）對JNKmRNA 表達(dá)的影響

由圖11 可知：與花青素0 μg/mL 組相比，花青素25.0 μg/mL 組和SP600125 10 μmol/L 組的JNKmRNA 表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），花青素25.0 μg/mL+SP600125 10 μmol/L 組 的JNKmRNA 表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）。與SP600125 10 μmol/L 組相比，花青素25.0 μg/mL+SP600125 10 μmol/L組的JNKmRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。表明黑枸杞花青素與JNK 通路抑制劑SP600125 有協(xié)同作用，進(jìn)一步證明JNK 通路可能在黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡中發(fā)揮調(diào)控作用。

圖11 黑枸杞花青素(AC)結(jié)合SP600125 對JNK mRNA 表達(dá)的影響Fig.11 Effect of black wolfberry anthocyanin（AC）combined with SP600125 on the expression of JNK mRNA

（2）對p-JNK 蛋白表達(dá)的影響

由圖12 可知：與花青素0 μg/mL 組相比，花青素25.0 μg/mL 組、SP600125 10 μmol/L 組和花青素25.0 μg/mL+SP600125 10 μmol/L 組的p-JNK蛋白表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）；與SP600125 10 μmol/L 組相比，花青素25.0 μg/mL+SP600125 10 μmol/L 組的p-JNK 蛋白表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）。表明黑枸杞花青素與JNK 通路抑制劑SP600125 有協(xié)同作用，進(jìn)一步證明黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡與JNK 通路調(diào)控有關(guān)。

圖12 黑枸杞花青素(AC)結(jié)合SP600125 對p-JNK 的蛋白表達(dá)的影響Fig.12 Effect of black wolfberry anthocyanin（AC）combined with SP600125 on the protein expression of p-JNK

3 討論

黑枸杞作為青藏高原特有的野生植物，富含花青素，且具有多種生物活性，可有效提高機(jī)體免疫力[1-4]。因此，開發(fā)青海省黑枸杞作為免疫增強(qiáng)劑對青海省農(nóng)牧業(yè)發(fā)展具有積極作用。

細(xì)胞凋亡是受多基因復(fù)雜調(diào)控的細(xì)胞程序化死亡，涉及胞內(nèi)相關(guān)因子激活、表達(dá)及調(diào)控等，對機(jī)體免疫防御和細(xì)胞損傷等具有重要作用[5-8]。Caspase-3通過分解胞內(nèi)底物激活凋亡通路參與凋亡[9]。Caspase級聯(lián)反應(yīng)可通過細(xì)胞受體和線粒體凋亡等途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-12]。本研究結(jié)果顯示：隨著黑枸杞花青素質(zhì)量濃度的增加，Caspase-3mRNA 及蛋白表達(dá)降低，說明黑枸杞花青素能通過降低Caspase-3mRNA 及蛋白表達(dá)抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡，調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫功能。

據(jù)報道，Bax和Bcl-2屬于Bcl-2基因家族成員，Bcl-2為凋亡抑制基因，Bax為促凋亡基因，Bax/Bcl-2比值越高，凋亡狀況越嚴(yán)重[13-15]。Bcl-2能抑制線粒體內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶及誘凋因子細(xì)胞色素C 的釋放，干擾Caspase-3活化以發(fā)揮抗凋亡的作用，因此，認(rèn)為Bcl-2可能抑制Caspase-3合成[13-15]。本研究結(jié)果顯示：隨著黑枸杞花青素質(zhì)量濃度增加，Bcl-2mRNA 及蛋白表達(dá)升高，Bax/Bcl-2表達(dá)量比值下降。形態(tài)學(xué)檢測及流式檢測也證明了黑枸杞花青素可抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡。由此說明黑枸杞花青素能通過增高Bcl-2mRNA 及蛋白表達(dá)抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡，調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫功能。

JNK 通路在細(xì)胞凋亡通路中占據(jù)中心位置，可有效調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡等多種生理及病理過程，通過降低JNK 磷酸化抑制凋亡，對細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病防治具有重要意義[16-18]。本研究結(jié)果顯示：隨著黑枸杞花青素質(zhì)量濃度的增加，JNK 通路因子JNKmRNA 及p-JNK 蛋白表達(dá)降低且呈劑量依賴性。JNK 通路特異性抑制劑SP600125能高選擇性地抑制JNK 激酶從而抑制JNK 磷酸化[19]，為進(jìn)一步說明JNK 通路與凋亡的關(guān)系，本試驗(yàn)設(shè)置了JNK 抑制劑SP600125 及黑枸杞花青素+SP600125 處理組，與JNK 抑制劑組相比，抑制劑與花青素共處理組能顯著降低JNKmRNA表達(dá)（P＜0.05），極顯著降低JNK 通路因子p-JNK蛋白表達(dá)（P＜0.01）；DAPI 和Hoechst 染色結(jié)果顯示：花青素可抑制巨噬細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：黑枸杞花青素可極顯著降低小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 凋亡率（P＜0.01），由此說明黑枸杞花青素可以通過降低JNK 通路因子JNKmRNA及p-JNK 蛋白表達(dá)抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡，調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫功能。

4 結(jié)論

黑枸杞花青素通過下調(diào)JNK 通路因子JNK和凋亡因子Caspase-3mRNA 表達(dá)水平、Caspase-3 和p-JNK 的蛋白表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2mRNA 表達(dá)水平來抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡，其機(jī)制可能是通過調(diào)控JNK 信號通路得以實(shí)現(xiàn)，說明黑枸杞花青素可通過JNK 通路抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 的凋亡調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫功能。研究結(jié)果以期為青海柴達(dá)木黑枸杞花青素作為免疫增強(qiáng)劑提供理論基礎(chǔ)。