陳自宏，張鴨關(guān)，徐 玲 ，何謦成

（1.保山學(xué)院 高黎貢山生物資源研究所，云南 保山 678000；2.曲靖師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 學(xué)報編輯部，云南 昆明 650201）

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾屬（Spodoptera）的遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲[1]。它原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，2016 年遷徙至非洲和亞洲各國，2019 年1 月經(jīng)云南跨境入侵中國并在國內(nèi)暴發(fā)，對中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形成巨大威脅，云南更是其重災(zāi)區(qū)[2]。草地貪夜蛾具有雜食性，可為害76 屬353 種植物，對玉米、高粱、水稻、花生、甘蔗、大豆和蔬菜等186 種重要農(nóng)作物造成嚴(yán)重威脅[3]。根據(jù)草地貪夜蛾的寄主植物偏好性，可將其分為“玉米型”和“水稻型”2 種生態(tài)型，入侵中國的草地貪夜蛾為“玉米型”，主要取食玉米和高粱[4]。由于草地貪夜蛾在中國入侵和蔓延的時間較短，目前主要防治方法還是化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境、人類健康及其他非靶標(biāo)生物的安全性問題一直備受關(guān)注，且該蟲的抗藥性較強[5]，亟需加強其生物防治的研究。

用蟲生真菌防控害蟲是一種重要的生防手段，具有安全、高效和可持續(xù)性等優(yōu)勢[6]，是草地貪夜蛾可持續(xù)防治的重要發(fā)展方向。目前，用于草地貪夜蛾防控的蟲生真菌包括球孢白僵菌[7-8]、萊氏綠僵菌[9]、金龜子綠僵菌和玫煙色蟲草[10]等。白僵菌屬真菌是重要的蟲生真菌，尤其是球孢白僵菌（Beauveria bassiana）被認(rèn)為是最具開發(fā)潛力的蟲生真菌之一[11]，在國內(nèi)外已被廣泛用于害蟲的生防研究和產(chǎn)品開發(fā)，全球超過30%的生防菌劑均以球孢白僵菌為有效成分[12]。

云南省保山市是玉米的重要生產(chǎn)基地，草地貪夜蛾已成為玉米田害蟲的優(yōu)勢種類[13]。本研究著眼于保山特殊的自然地理條件，通過對不同地域來源的10 種共計15 株白僵菌對草地貪夜蛾的毒力測定，篩選高毒力優(yōu)良菌株，并對球孢白僵菌的寄主感染癥狀及在保山農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的消長動態(tài)進行分析，為白僵菌在草地貪夜蛾生物防治中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10 種白僵菌共15 株菌株，分離自保山市（6 種8 株）及其周邊市區(qū)（怒江州和大理州）的土壤或罹病昆蟲（表1），保存于保山學(xué)院高黎貢山生物資源研究所；草地貪夜蛾采集自保山市的玉米田，在實驗室人工飼養(yǎng)獲得大量幼蟲；黃粉蟲（Tenebrio molitor）幼蟲由保山學(xué)院高黎貢山生物資源研究所提供。

1.2 研究方法

1.2.1 草地貪夜蛾的飼養(yǎng)

參照羅成等[14]的培養(yǎng)方法并進行改良。在無菌罐頭瓶底放1 層無菌濾紙，將草地貪夜蛾卵塊置于其中，25 ℃孵化后取玉米葉片飼喂，將幼蟲轉(zhuǎn)移到新罐頭瓶中，每天更換無菌濾紙并飼喂新鮮玉米葉。選3 齡幼蟲作為毒力測定的寄主。

1.2.2 白僵菌菌株的毒力測定

采用爬行接種法[15]測定各菌株的毒力。用PPDA 培養(yǎng)基（洋芋粉20 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g）進行菌株的產(chǎn)孢培養(yǎng)。每個菌株共處理30 頭幼蟲，分3 組進行。每組用1 個無菌平皿，取0.5 g 白僵菌分生孢子粉平鋪于皿底，放入10 頭草地貪夜蛾幼蟲自由爬行2 min。接種后的幼蟲，每頭分別置于1 個無菌罐頭瓶內(nèi)，于25 ℃下用玉米嫩葉飼養(yǎng)，至蟲體死亡。對照為未接菌處理的30 頭幼蟲，每瓶1 頭，以玉米嫩葉正常飼養(yǎng)。

逐日觀察記錄寄主死亡情況，以半致死時間（LT50）、全致死時間和校正致死率為指標(biāo)評價各菌株的毒力。致死時間以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；校正致死率=[（處理致死率-對照致死率）/（1-對照致死率）]×100%。

1.2.3 球孢白僵菌在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的消長動態(tài)

在云南省保山市分別選取多年生作物農(nóng)田（潞江壩的咖啡園和騰沖的茶園）和一年生作物農(nóng)田（潞江壩的玉米田和騰沖的煙田）采集作物根際土壤樣品。于2019 年1—12 月，每月中旬到各農(nóng)田中取樣1 次；每種作物農(nóng)田選取3 個樣方，每個樣方取4 個對角小樣方和1 個中心小樣方（每個小樣方為2 m×2 m），在每個小樣方中取1 個土樣。取樣時，在作物根際30 cm 以內(nèi)，用小鏟取表層5 cm 的土壤300～400 g。各土壤樣品帶回實驗室后，于3 d 內(nèi)進行處理。

參考KEYSER 等[16]的方法，用7 齡黃粉蟲幼蟲從土壤樣品中誘導(dǎo)分離白僵菌菌株，挑取被感染蟲體表面分生孢子粉，于PPDA 培養(yǎng)基上純化菌株，結(jié)合菌落形態(tài)特征和5 個基因序列（nrSSU、nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2）的系統(tǒng)發(fā)育分析來鑒定白僵菌物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 白僵菌不同物種對草地貪夜蛾的毒力

由表1 可知：接種草地貪夜蛾3 齡幼蟲的不同白僵菌菌株毒力存在差異，校正致死率在10%～100%之間；其中，有3 株菌的校正致死率低于50%，其余12 株菌的校正致死率都達50%以上，LT50為2.3～12.6 d。有9 株菌的毒力較強，校正致死率達到100%，分別為：球孢白僵菌（B.bassiana）菌株BUB12、BUB8、BUB3 和BUB9，中國白僵菌（B.sinensis）菌株BUB51，馬拉維白僵菌（B.malawiensis）菌株BUB444，布氏白僵菌（B.brongniartii）菌株BUB78，保山白僵菌（B.baoshanensis）菌株BUB283，假球孢白僵菌（B.pseudobassiana）菌株BUB1234；但其致死速度不同，全致死時間為4.4～15.7 d，LT50為2.3～10.3 d。多數(shù)球孢白僵菌菌株的毒力都較強，不同來源的6 株菌中有4 株菌的校正致死率達到100%，其中分離自保山市潞江壩怒江江邊沙灘的菌株BUB12 致死速度最快，其全致死時間（4.4 d）和LT50（2.3 d）最短，說明其毒力最高；分離自保山市騰沖烤煙田土壤中的菌株BUB8 的毒力（全致死時間5.8 d，LT50=2.5 d）僅次于菌株BUB12 。

表1 供試白僵菌的菌株信息及其毒力Tab.1 The strains information of the tested Beauveria and their virulence

由表1 還可知：來自不同地區(qū)的白僵菌菌株毒力存在差異，來自同一地區(qū)的不同菌株毒力也存在差異。來自保山市5 個區(qū)域（潞江壩、芒寬、太保山、百花嶺和騰沖）的白僵菌共6 種10 株菌，其中有1 株從螞蟻上分離到的墨脫白僵菌（B.medogensis）菌株毒力最弱，校正致死率為40%，其他9 株菌的校正致死率均≥60%。來自怒江州2 個區(qū)域（獨龍江和貢山）的3 種3 株白僵菌的校正致死率在40%～100%。來自大理州永平和巍山的2 種2 株白僵菌的校正致死率差異較大（分別為100% 和10%），其中來自巍山的云南白僵菌（B.yunnanensis）菌株BUB1232 在所有菌株中毒力最弱（校正致死率10%）。

2.2 球孢白僵菌感染草地貪夜蛾和黃粉蟲的癥狀

用毒力最強的球孢白僵菌菌株BUB12 接種草地貪夜蛾3 齡幼蟲，讓幼蟲在盛有分生孢子粉的平皿中爬行后，體表附著大量孢子，單頭幼蟲轉(zhuǎn)移到無菌罐頭瓶，此時蟲體還保持較高的活力，在瓶中自由爬行并食用玉米葉片，其爬行過程中，會有部分孢子從蟲體上滑落，但仍有一些留在氣孔、體節(jié)、足和剛毛等部位（圖1a）。隨著真菌孢子侵入蟲體后，幼蟲活動逐漸減慢，取食減少；接菌第4 天后，蟲體基本停止爬行，死亡；接菌第5 天，肉眼能看到多數(shù)蟲體表面長出白僵菌菌絲（圖1b）；接菌第8 天所有蟲體已經(jīng)被菌絲及白色分生孢子層完全包裹（圖1c）。

在各農(nóng)田土壤樣品中放置黃粉蟲7 齡幼蟲15～20 d，被感染的黃粉蟲體表包被白色菌絲，并產(chǎn)生大量白色孢子粉（圖1d），挑取孢子粉抖落在PPDA 培養(yǎng)基平皿中，約2 周后培養(yǎng)基表面形成球孢白僵菌菌落，菌落邊緣菌絲呈白色，表面形成1 層白色孢子粉（圖1e）。

圖1 球孢白僵菌感染寄主癥狀Fig.1 The symptoms of host infected by Beauveria bassiana

2.3 球孢白僵菌在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的消長動態(tài)

調(diào)查結(jié)果（圖2）表明：球孢白僵菌在保山市4 種農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中（咖啡園、茶園、玉米田和煙田）全年都有分布，共分離到328 株菌。球孢白僵菌的菌株數(shù)量隨著季節(jié)溫、濕度變化而呈現(xiàn)出明顯的漸變規(guī)律?？傮w來看，6—8 月（夏季）菌株檢出率較高，其中7 月菌株檢出率最高（57 株，占總數(shù)的17.4%）；3—5 月（春季）及9—11 月（秋季）菌株檢出率較低；12 月—次年3 月（冬季）菌株檢出率最低。菌株數(shù)于1—7 月呈逐漸增多的趨勢，7—12 月呈逐漸減少的趨勢，12 月菌株數(shù)量最少（7 株，占總數(shù)的2.1%）。

不同作物農(nóng)田中球孢白僵菌的分布有所差異（圖2）?？傮w上看，茶園和咖啡園中分離到的菌株數(shù)最多（分別為99 株和98 株），玉米田中的菌株數(shù)相對較少（74 株），煙田中菌株數(shù)最少（57株）。茶園在6—8 月的菌株數(shù)量最占優(yōu)勢，咖啡園的菌株數(shù)量在2—5 月較占優(yōu)勢。煙田中多數(shù)月份的菌株數(shù)量都明顯少于其他農(nóng)田。

圖2 4 種典型農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)球孢白僵菌的月間消長動態(tài)Fig.2 Monthly dynamics of B.bassiana in four kinds of field ecosystem

3 討論

草地貪夜蛾自入侵中國以來，蟲情擴散蔓延迅速，發(fā)生代數(shù)增多，對玉米等農(nóng)作物造成非常嚴(yán)重的危害。草地貪夜蛾的防控迅速成為相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的重點，以白僵菌和綠僵菌為主的蟲生真菌對草地貪夜蛾的防控近年來也成為國內(nèi)外研究的熱點。AKUTSE 等[17]分析了14 株綠僵菌和6 株白僵菌對草地貪夜蛾的毒殺效果，發(fā)現(xiàn)只有1 株白僵菌菌株ICIPE676 對2 齡幼蟲的致死率達30%，其他菌株只對卵和1 齡幼蟲有防效。THOMAZONI 等[18]用35 株白僵菌和14 株綠僵菌接種3 齡草地貪夜蛾，發(fā)現(xiàn)只有1 株白僵菌毒力較強（致死率44.5%）。趙勝園等[19]測定了抗生素、微生物和植物源生物農(nóng)藥對草地貪夜蛾的防效，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌菌株OF 對2 齡幼蟲的防效較好（致死率60%）。山西綠海農(nóng)藥科技有限公司研發(fā)的球孢白僵菌可濕性粉劑（農(nóng)藥登記證號PD20190002）獲批成為國內(nèi)首個應(yīng)用于草地貪夜蛾防治的生物農(nóng)藥[20]。以上研究表明：白僵菌在草地貪夜蛾的防控中具有較為重要的地位。本研究用爬行法接種草地貪夜蛾3 齡幼蟲，篩選到2 株球孢白僵菌菌株BUB12 和BUB8 毒力最強，其校正致死率均為100%，致死速度較快（全致死時間分別為4.4 和5.8 d，LT50分別為2.3 和2.5 d）。雷妍圓等[21]研究表明：球孢白僵菌菌株GZSL-1 對草地貪夜蛾6 個齡期的幼蟲都有致病性，對1～3 齡幼蟲的校正致死率都能達到100%，用1.0×108個/mL 孢子的菌懸液處理3 齡幼蟲，LT50=3.12 d。GARCíA 等[22]用白僵菌菌株Bb42 1.0×109個/mL 孢子的菌懸液處理2 齡幼蟲，致死率為96.6%，LT50=3.6 d。本研究中球孢白僵菌菌株BUB12 和BUB8 的LT50較短，可能是爬行接種法使蟲體表面粘附較多真菌孢子造成的影響，這些菌株的毒力還需通過統(tǒng)一的接種方法和接種條件進行進一步的比較。

農(nóng)田環(huán)境中存在一些蟲生真菌，保護和利用這些真菌資源對草地貪夜蛾的防治具有重要意義。程東美等[23]調(diào)查廣州地區(qū)草地貪夜蛾的僵蟲自然發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)蟲體在田間被真菌自然寄生的現(xiàn)象較多，累積僵蟲率高達43.21%，分離到的自然寄生真菌白僵菌菌株對3 齡幼蟲有較好的致病作用。鄭亞強等[24]在云南曲靖沾益安東村玉米田中調(diào)查被蟲生真菌感染的草地貪夜蛾，發(fā)現(xiàn)綠僵菌感染率7 月中旬為15.46%，8 月初上升為29.83%。本研究中球孢白僵菌多數(shù)菌株對草地貪夜蛾的毒力較強（6 株菌中4 株的致死率達100%）；調(diào)查保山市4 種農(nóng)田中球孢白僵菌的消長動態(tài)結(jié)果表明：4 種類型農(nóng)田土壤中球孢白僵菌的季節(jié)分布規(guī)律相似，即全年均有分布，夏季（6—8 月，田間溫濕度最高的月份）菌株數(shù)量最多。這與自然界中大多數(shù)蟲生真菌的季節(jié)變化趨勢一致[25-26]。從不同類型作物農(nóng)田來看，茶園和咖啡園都屬于多年生作物農(nóng)田，其菌株數(shù)量最多；而玉米田和煙田屬于一年生作物農(nóng)田，其菌株數(shù)量相對較少，尤其是煙田中分離到的菌株數(shù)量最少。這可能與不同栽培模式田地受人為擾動因素的影響不同有關(guān)，而煙葉中煙堿的抑菌作用可能也會影響煙田中的菌株數(shù)量。HUMMEL 等[27]認(rèn)為：蟲生真菌的生存繁衍受耕作模式的影響較大；王品[26]研究表明：人為干預(yù)的生態(tài)茶園中蟲生真菌的種群密度明顯低于野生茶園。可見，適當(dāng)減少土壤耕作次數(shù)，降低化學(xué)肥料和藥劑的施用，保護農(nóng)田自然生態(tài)環(huán)境，有利于提高農(nóng)田土壤中球孢白僵菌的種群數(shù)量，發(fā)揮其自然控蟲潛力。草地貪夜蛾入侵以來，云南省農(nóng)田玉米苗期受害日益嚴(yán)重[28]。隨著田間寄主害蟲的數(shù)量變化，球孢白僵菌的農(nóng)田消長動態(tài)分布可能也會發(fā)生變化，如隨著玉米田中草地貪夜蛾危害的逐年增加，其田間土壤中的球孢白僵菌數(shù)量是否會增加，還需要進一步追蹤調(diào)查。

4 結(jié)論

來自保山市5 個區(qū)域（潞江壩、芒寬、太保山、百花嶺和騰沖）、怒江州2 個區(qū)域（獨龍江和貢山）和大理州2 個區(qū)域（永平和巍山）的10 種共15 株白僵菌中，有9 株菌的毒力較強，校正致死率都達100%，但致死速度不同，從保山市潞江壩怒江江邊沙灘分離到的菌株BUB12 致死速度最快，其次為保山市騰沖煙田土壤中的菌株BUB8，這2 株高毒力菌株在草地貪夜蛾的真菌防控中具有良好的應(yīng)用潛力。保山市4 種農(nóng)田土壤中，球孢白僵菌全年都有分布，夏季菌株檢出率最高，春季和秋季菌株較低，冬季最低；多年生作物農(nóng)田（茶園和咖啡園）中菌株數(shù)量較多，一年生作物農(nóng)田（玉米田和煙田）中菌株數(shù)量較少。