張 暉，薛彬娥，張碧佩，董 斌，吳 偉，郭 微，陳 平，李永泉

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510507）

陰香Cinnamomum burmannii屬于樟科Lauraceae 樟屬Cinnamomum，別名廣東桂皮、香膠葉，是一種常綠喬木，高達(dá)20 m有余，胸徑約80 cm。在我國，陰香主要分布于廣東、廣西、江西、福建、浙江、湖北和貴州，喜陽光，喜暖熱濕潤氣候及肥沃濕潤土壤，常生于肥沃、疏松、濕潤而不積水的 地方[1]。

樟科樟屬樹種葉片精油的功能性成分歷來得到廣泛關(guān)注[2-6]，在其葉片中發(fā)現(xiàn)的樟腦、黃樟油素、檸檬醛、龍腦和芳樟醇等成分被用于輕化工、醫(yī)藥和食品工業(yè)上[7-8]。然而關(guān)于陰香根部內(nèi)含的功能性藥用成分研究鮮有報道。植物內(nèi)生細(xì)菌的種類繁多，在各種經(jīng)濟作物中已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌超過129 種，隸屬于54 個屬，這些內(nèi)生細(xì)菌大多為土壤微生物，主要為假單胞菌屬Pseudomonas、腸桿菌屬Enterobacter、芽胞桿菌屬Bacillus、土壤桿菌屬Agrobacterium等[9-10]，其新陳代謝活躍，且在代謝過程中能夠產(chǎn)生并累積一些結(jié)構(gòu)獨特、骨架新穎的活性次級代謝產(chǎn)物。部分藥用植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物與其宿主植物有相似甚至相同的活性。已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生菌生物活性成分多為抗腫瘤活性成分，其次是抗菌活性物質(zhì)、抗瘧和抗病毒物質(zhì)，此外還包括植物生長促進素、殺蟲活性物質(zhì)和免疫抑制活性物質(zhì)等成分，代謝產(chǎn)物類型有萜類、多糖、醌類、生物堿類、多肽類和內(nèi)酰胺類等[11]。

目前，關(guān)于陰香成分的研究主要集中在揮發(fā)油方面，主要揮發(fā)性物質(zhì)為龍腦、桉樹腦、蒎烯、檸檬烯和石竹烯等[12-13]。有研究結(jié)果表明，陰香葉的乙醇提取物能減緩儲藏石榴的水分散失和果實腐爛，保持果皮葉綠素含量和果實硬度，還能有效抑制果實過氧化物酶活性[14]。關(guān)于陰香根部和特異性樹瘤組織的功能性成分的研究鮮見報道。本文中以正常生長的陰香根和基于根部生長的樹瘤組織及根際土為研究對象，分析細(xì)菌群落組成，比較陰香根和樹瘤中內(nèi)含的功能性中藥成分，旨在為進一步開發(fā)陰香的藥用資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究對象為普通陰香根部和基于根部長出的陰香樹瘤組織（圖1）。隨機從3 棵無樹瘤的陰香植株各取2 g 根木質(zhì)部樣品及其根際土樣品，共3個重復(fù)；從陰香樹瘤組織隨機采集2 g 皮層下樣品及其根際土樣品，共3 個重復(fù)。

圖1 正常和長樹瘤的陰香根部Fig.1 The root of normal growth C.burmanni and burl grew from root

1.2 樣品中細(xì)菌檢測

1.2.1 細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測序

采用CTAB 法對樣本的基因組DNA 進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量樣品DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用特異引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）， 對16S rRNA 基因的V3 ～V4 高變區(qū)片段進行PCR 擴增。

PCR 反應(yīng)體系：2×Phusion Master Mix 15 μL， 正、反向引物（2 μmol/L）各3 μL，基因組DNA （1 ng/μL）7 μL，ddH2O 2 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。使用2%的瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE（含2%的瓊脂糖膠）電泳純化PCR 產(chǎn)物，回收目標(biāo)條帶。使用MiSeq/Hiseq 平臺對16S rDNA 的1 個或多個高變區(qū)進行雙末端（paired-end）測序。

1.2.2 細(xì)菌多樣性分析

使用Cutadapt 軟件[15]對Reads進行過濾，按Barcode 拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列，去除嵌合體序列[16]，得到最終有效數(shù)據(jù)。使用Uparse 軟件[17]對序列進行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。根據(jù)OTU聚類結(jié)果，利用SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫[18]對每個OTU的代表序列進行物種注釋，獲得分類學(xué)信息和各樣本在各分類水平上的群落組。同時，使用QIIME V1.9.1 軟件進行OTU 豐度與多樣性指數(shù)計算，得到樣品內(nèi)物種豐富度信息，并基于KEGG對其代謝功能進行預(yù)測。

1.3 樣品中功能性成分分析

取陰香根部和樹瘤部樣品各2 g，分別加入 20 mL 95%的乙醇進行萃取。萃取30 min 后，使用0.45 μm 微孔濾膜過濾得待檢樣品，使用Waters Xevo G2-XS QTof 高分辨質(zhì)譜儀進行色譜分析，檢索數(shù)據(jù)庫為ESI+中藥庫。

色譜分析條件：色譜柱采用C18（1.7 μm， 2.1 mm×100 mm)，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～45 min，10%～100% B；45 ～55 min，100% B），流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

質(zhì)譜分析條件：離子化模式為電噴霧正離子模式時，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓（declustering potential，DP）為100 V，碰撞能量（collision energy，CE）為35 eV，碰撞能量擴展（collision energy spread，CES）為15 eV，霧化氣體為氮氣。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍50 ～1 200，子離子掃描范圍50 ～ 1 200。離子化模式為電噴霧負(fù)離子模式時，離子源電壓為-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓為100 V，碰撞能量為-35 eV，碰撞能量擴展為15 eV。霧化氣體為氮氣，一級質(zhì)譜母離子掃描范圍50 ～1 200，子離子掃描范圍50 ～1 200。

1.4 統(tǒng)計分析

使用WPS 的Excel V.2020 軟件整理數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0 軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰香根部和樹瘤及其根際土細(xì)菌群落多樣性比較

在供試陰香根際土樣品中共檢測到細(xì)菌32 門122 綱227 目356 科543 屬，在陰香根部樣品中共檢測到細(xì)菌28 門100 綱184 目299 科487 屬，在陰香樹瘤根際土樣品中共檢測到細(xì)菌36 門122 綱230 目353 科546 屬，在陰香樹瘤樣品中共檢測到細(xì)菌30 門110 綱202 目319 科493 屬。

2.1.1 根和樹瘤及其根際土細(xì)菌群落門水平組成比較

陰香根和樹瘤及其根際土細(xì)菌群落門水平組成見表1。由表1 可知，陰香根際土與樹瘤根際土的微生物組成在門水平上，豐度最高為變形菌門Proteobacteria，分別為33% 和30%，其次分別為酸桿菌門Acidobacteria、泉古菌門Crenarchaeota、擬桿菌門Bacteroidetes、浮霉菌門Planctomycetes、放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、疣微菌門Verrucomicrobia、硝化螺旋菌門Nitrospirae、 芽單胞菌門Gemmatimonadetes、壁厚菌門Firmicutes、藍(lán)藻門Cyanobacteria、裝甲菌門Armatimonadetes、迷蹤菌門Elusimicrobia、綠菌門Chlorobi、廣古菌門Euryarchaeota。個別門類在豐度上會有明顯差異，陰香樹瘤根際土的壁厚菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門、泉古菌門的相對豐度較陰香正常根際土分別高166.67%、84.62%、83.65%、346.34%、42.86%，放線菌門、綠菌門、綠彎菌門、迷蹤菌門、芽單胞菌門、疣微菌門的相對豐度較陰香正常根際土分別減少了28.40%、33.33%、28.44%、57.14%、27.00%、37.09%。

表1 陰香根和樹瘤及其根際土細(xì)菌群落門水平組成及其 豐度Table 1 Phylum level composition of root and burl of C.burmannii and rhizosphere soil bacterial community %

陰香根部與樹瘤的細(xì)菌群落組成在門級別種類上無明顯差異，已確認(rèn)的有變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、酸桿菌門Acidobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、壁厚菌門Firmicutes、疣微菌門Verrucomicrobia、放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、泉古菌門Crenarchaeota、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、藍(lán)藻門Cyanobacteria、硝化螺旋菌門Nitrospirae綠菌門Chlorobi、廣古菌門Euryarchaeota、裝甲菌門Armatimonadetes、Thermi、螺旋體門Spirochaetes、迷蹤菌門Elusimicrobia、衣原體門Chlamydiae、Parvarchaeota。在相對豐度上，陰香樹瘤的細(xì)菌群落組成較正常根部有明顯增加，其中變形菌門、綠菌門、泉古菌門、硝化螺旋菌門的相對豐度分別增加了76.61%、250.00%、117.65%、109.09%，放線菌門、藍(lán)藻門的相對豐度較陰香正常根分別減少了63.16%、97.00%。

2.1.2 根和樹瘤細(xì)菌群落屬水平組成比較

陰香根和樹瘤細(xì)菌群落屬水平組成及其豐度變化見表2。由表2 可知，陰香正常根部細(xì)菌群落相對豐度較高的屬依次為鞘脂單胞菌屬、擬桿菌目未知屬、假單胞菌屬Pelomonas、Chitinophagaceae未知屬、乳桿菌屬、鞘脂單胞菌科未知屬、Nitrososphaera屬、酸桿菌門未知屬、β-變形菌綱未知屬，其相對豐度分別為38.45%，2.71%、2.25%、1.55%、1.53%、1.40%、1.24%、1.06%和1.03%。陰香樹瘤細(xì)菌群落相對豐度最高的屬與正常根部一樣，為鞘脂單胞菌屬，相對豐度為51.35%，較陰香正常根部增加了33.56%，其余樹瘤細(xì)菌群落相對豐度大于1%的分別為假單胞菌屬（4.63%）、鞘脂單胞菌科未知屬（2.23%）、Chitinophagaceae 未知屬（1.65%）、Nitrososphaera（1.25%）、Kaistobacter（1.08%）。慢生根瘤菌科Bradyrhizobiaceae（包括慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium）在陰香正常根中的總豐度為0.44%，在陰香樹瘤中的總豐度為0.84%，增幅為90%。

表2 陰香根和樹瘤細(xì)菌群落屬水平組成及其豐度?Table 2 Genus-level composition and variation of bacterial groups in C.burmannii root and burl %

2.1.3 根和樹瘤及其根際土細(xì)菌群落多樣性指數(shù)比較

陰香根和樹瘤及其根際土細(xì)菌群落的辛普森多樣性指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)如圖2所示。由圖2 可見，除陰香樹廇部細(xì)菌群落的辛普森多樣性指數(shù)外，陰香根際土和樹瘤根際土的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)與陰香根部和樹瘤部的多樣性指數(shù)差異顯著，說明陰香根部和樹瘤部的細(xì)菌群落豐富度顯著低于根際土細(xì)菌群落的豐富度。陰香根部根際土與樹瘤部根際土的細(xì)菌群落多樣性的差異不顯著。

圖2 陰香根和樹瘤及其根際土細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Fig.2 Comparison of bacterial community alpha diversity in root, burl and rhizosphere soil of C.burmannii

2.2 陰香根部和樹瘤細(xì)菌群落KEGG 代謝功能預(yù)測

陰香根部和樹瘤細(xì)菌群落KEGG 代謝功能預(yù)測結(jié)果見表3。由表3 可知，陰香正常根部和樹瘤部中細(xì)菌群落的主要代謝類型為氨基酸代謝、糖類代謝和能量代謝，其中樹瘤中細(xì)菌群落的氨基酸代謝較正常根提高了41%，其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、聚糖生物合成與代謝、糖類代謝、脂質(zhì)代謝、萜類和聚酮類化合物的代謝分別較正常根提高了27.27%、25.93%、14.83%、19.54%和

表3 陰香根部和樹瘤細(xì)菌群落KEGG 代謝功能預(yù)測Table 3 KEGG metabolic function prediction of C.burmannii root and burl %

12.50%。

2.3 陰香根部和樹瘤內(nèi)功能性成分比較

根據(jù)ESI+中草藥庫比對結(jié)果，在陰香根部共檢測出60 種功能性成分化合物，在樹瘤部共檢測出139 種功能性成分化合物，其中共有組分為20種（表4）。其中，麻黃考寧（麻黃根素）、2′,4′,3,4-四羥基-β-羥基查耳酮為類黃酮化合物，水蘇堿、去甲豬毛菜堿、黃堇堿、N-異丁基-2E,4E-十八碳二烯酰胺為生物堿類。由表4 可知，陰香樹瘤中各成分的響應(yīng)值高于根部，其中去甲豬毛菜堿在樹瘤中的響應(yīng)值是在根部中的20 倍。

表4 陰香根部與樹瘤所含共有功能性成分Table 4 The root and burl of C.burmannii shared functional components

在陰香根部與樹瘤的差異性成分中，陰香根部含有的主要類黃酮有雙氫山柰酚、(2R,3R)-3,5,7,3′,5′-五 羥 基黃烷酮、5,4′-二羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮等；陰香樹瘤有12 種差異性類黃酮，主要為(3α,4β,5α)-4,5-二氫-(1-吡咯基)-4,5-二甲基-2(3H)-呋喃酮、越南槐醇和桑皮根素氫過氧化物。陰香根部含有的差異性萜類化合物主要有α-檀香醇、去氫白菖烯、δ-蛇床烯等6 種；陰香樹瘤含有17 種差異性萜類化合物，包括香樟烯、莪術(shù)烯等。陰香根部含有3 種差異性生物堿類化合物；樹瘤含有青藤堿、附子堿、右旋衡州烏藥堿、D-異波爾定堿、可待因和亞美罌粟堿等22 種，并且生物堿成分的響應(yīng)值明顯高于同組織中的類黃酮和萜類化合物。陰香根部與樹瘤的差異性類黃酮化合物、萜類和生物堿類化合物中響應(yīng)值在前6位的功能性成分分別見表5。

表5 陰香根部與樹瘤所含差異性功能性成分（響應(yīng)值在前6 位）Table 5 Comparison of flavonoids compounds between root and burl of C.burmannii (the response value was in the top 6)

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，陰香根際土與樹瘤根際土的細(xì)菌群落組成在門水平上無差異，陰香根部與樹瘤的細(xì)菌群落組成在門級別種類上也無明顯差異，但是根際土中細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)顯著高于根部和樹瘤組織中的細(xì)菌群落。從整體來看，細(xì)菌群落豐度最高均為變形菌門。陰香樹瘤根際土的壁厚菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門、泉古菌門細(xì)菌群落的相對豐度分別較正常根根際土高166.67%、84.62%、83.65%、346.34%、42.86%；陰香樹瘤根際土的放線菌門、綠菌門、綠彎菌門、迷蹤菌門、芽單胞菌門、疣微菌門細(xì)菌群落的相對豐度分別較正常根根際土減少了28.40%、33.33%、28.44%、57.14%、27.00%、37.09%。 陰香根部屬水平上細(xì)菌群落的豐度由高到低依次為鞘脂單胞菌屬、擬桿菌目未知屬、假單胞菌屬、Chitinophagaceae未知屬、乳桿菌屬、鞘脂單胞菌科、Nitrososphaera、酸桿菌門未知屬、β-變形菌綱未知屬。陰香樹瘤部細(xì)菌群落中相對豐度最高的屬與陰香根部一樣，為鞘脂單胞菌屬，其相對豐度為51.35%，較陰香正常根部增加了33.56%，然后依次為假單胞菌屬（4.63%）、鞘脂單胞菌科未知屬（2.23%）、Chitinophagaceae 未知屬（1.65%）、Nitrososphaera（1.25%）、Kaistobacter（1.08%）。從KEGG 結(jié)果來看，陰香正常根部和樹瘤部的主要代謝為氨基酸代謝、糖類代謝和能量代謝，其中樹瘤部氨基酸代謝的比例較根部提高了41%，樹瘤組織中類黃酮、萜類、生物堿類化合物種類明顯多于根部，其中樹瘤組織中生物堿類化合物的響應(yīng)值普遍高于類黃酮和萜類。

在自然界里較多喬木存在根瘤現(xiàn)象，如羅漢松屬植物普遍具有結(jié)瘤現(xiàn)象，其形狀多呈近球形或球形。黃寶靈等[19]對幾種羅漢松根瘤的形態(tài)和結(jié)構(gòu)進行了系統(tǒng)觀察，發(fā)現(xiàn)其與豆科植物的根瘤有較多相似之處，證明了其根瘤是由內(nèi)生細(xì)菌引起的。黃寶靈等[20]對羅漢松根瘤進行分離鑒定，得到一批根瘤菌菌種，發(fā)現(xiàn)了羅漢松-根瘤菌共生固氮體系。耿森等[21]對馬占相思接種根瘤菌，發(fā)現(xiàn)其根際土壤微生物總數(shù)量與未接種對照的差異極顯著，但未對根部微生物群落進行分析。

陰香樹瘤部細(xì)菌群落的組成在門級別種類上與正常根部無明顯差異，其相對豐度較正常根部有明顯的增加。一般認(rèn)為，木本雙子葉植物與放線菌中的弗蘭克氏菌（Frankia）促使植物形成根瘤，但在本研究結(jié)果中樹瘤組織中放線菌門細(xì)菌群落的豐度比正常根降低了63%。在陰香根部中慢生根瘤菌科細(xì)菌群落的相對豐度為0.44%，在樹瘤中為0.88%。無法證明基于根部的樹瘤狀結(jié)構(gòu)與放線菌門或慢生根瘤菌科細(xì)菌有直接關(guān)系。一般認(rèn)為，這種樹瘤可能是受環(huán)境影響或病菌侵入而形成，一直以來相關(guān)研究主要關(guān)注其對木材結(jié)構(gòu)的影響[22]。

陰香樹瘤組織中鞘脂單胞菌屬細(xì)菌群落的豐度遠(yuǎn)高于正常根，鞘脂單胞菌屬微生物菌落一般為圓形凸起，橘紅色，這可能是樹瘤組織顏色較正常根部更顯紅色的原因。目前，關(guān)于鞘脂單胞菌科中Sphingobium japonicumUT26[23]、Sphingobium francenseSp+[24]、Sphingobium indicumB90A[25]和Sphingomonassp.BHC-A 菌株[26]的研究結(jié)果均顯示其對六六六有降解作用，說明六六六對其無抑制作用，或其所需濃度較一般的菌株要高。鞘脂單胞菌屬細(xì)菌在陰香根和樹瘤中占有相當(dāng)大的比例，有可能對其他有抑菌活性的生物堿和類黃酮物質(zhì)產(chǎn)生拮抗作用，并與其他微生物一起協(xié)同代謝產(chǎn)生更多的功能性化合物。本試驗中KEGG 代謝預(yù)測結(jié)果顯示，樹瘤中氨基酸代謝比例較根部提高了41%，與樹瘤中生物堿類化合物種類的響應(yīng)值高于正常根部的結(jié)果一致。但本試驗中僅對根部和樹瘤及其根際土中微生物群落中的細(xì)菌進行了研究，在后續(xù)研究中可進一步對其真菌的多樣性進行分析。

本研究結(jié)果表明，陰香根和樹瘤組織中含有多種功能性成分，如類黃酮、生物堿類物質(zhì)，除了共同的生物堿類化合物（麻黃考寧、黃堇堿、去甲豬毛菜堿、水蘇堿）外，樹瘤中還含有青藤堿、附子堿、右旋衡州烏藥堿、D-異波爾定堿等，并且其響應(yīng)值均較高，說明在樹瘤中該類功能性成分含量較高。本研究中未對樹瘤組織提取物在抑菌方面的效果進行研究。從已有的報道來看，這些成分普遍具有抗菌、抗炎或抗氧化作用，因此在后續(xù)研究中，除了研究其功能性成分的季節(jié)性變化[27]，還應(yīng)重視挖掘開發(fā)陰香中精油以外的功效性成分，豐富其醫(yī)藥用途，為現(xiàn)代生物農(nóng)藥研究提供參考。