李彥華，馬紅帥，田 青，韓奇財(cái)

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450052)

骨肉瘤是一種高度侵襲性的原發(fā)性骨惡性腫瘤，高發(fā)于兒童和青少年。主要治療手段是新輔助化療+手術(shù)+術(shù)后化療，但患者往往對(duì)化療不敏感，容易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。因此，針對(duì)骨肉瘤尋找有效的治療靶點(diǎn)以及藥物十分重要［1-2］。受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)在細(xì)胞命運(yùn)的抉擇中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，已逐漸成為多種疾病治療的有效靶點(diǎn)之一［3］。但RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲及死亡等生物活性是否具有調(diào)整作用，尚不清楚。本研究擬通過小干擾核糖核酸(small interference ribonucleic acid,siRNA)干擾骨肉瘤細(xì)胞中RIPK1的表達(dá)，檢測(cè)RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲及死亡等生物功能的影響，明確RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物活性的調(diào)控作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料骨肉瘤MG63細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RIPK1、Cleaved caspase-3、p-RIPK3、RIPK3、磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(phosphorylated-mixed lineage kinase domain-like,p-MLKL)、β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTeck公司;倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司；流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將骨肉瘤MG63細(xì)胞株，以1×106個(gè)細(xì)胞接種于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。每3 d換液1次。細(xì)胞融合率達(dá)到80%，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙二胺四乙酸的胰酶消化細(xì)胞，傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染抑制RIPK1的表達(dá)設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞株的siRIPK1引物5’-GGAATATGAGTGATATGATdTdT-3’,5’-AUUGAUUCGGAGACUAUACdTdT-3’;5’-GAACCUGAUTAAAGCAGGAdTdT-3’,5’-CUACGAACUUAGGGCAGUCdTdT-3’; 5’-GAGCACGAAGCAGTAGCTGAdTdT-3’,5’-GGCUGUCAAGCUGCdTdT-3’。以上引物均由廣州銳博科技有限工作合成。使用Lipofectamine 3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后檢測(cè)RIPK1的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察siRNA干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞3 d后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長、形態(tài)變化，判斷細(xì)胞活性和增殖變化。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖定量分析細(xì)胞干預(yù)完畢后，向每孔加入20 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞以1×106個(gè)/L的細(xì)胞濃度接種于6孔板，細(xì)胞貼壁，干預(yù)；收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，分別加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液、5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙錠染色液，輕輕混勻；室溫，避光孵育20 min；隨后置于冰浴中；然后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集完細(xì)胞后，裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。RIPK1、Cleaved caspase-3、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL檢測(cè)參照課題組既往操作流程進(jìn)行，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜，體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜10 min×4次，二抗常溫孵育2 h，洗膜10 min×4次,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光、壓片，上機(jī)檢測(cè)蛋白條帶［4］。

2 結(jié)果

2.1 干擾骨肉瘤細(xì)胞siRIPK1篩選結(jié)果Western blot分析結(jié)果顯示，不同siRIPK1干擾后，空白對(duì)照組、siRIPK1-1組、siRIPK1-2組、siRIPK1-3組骨肉瘤細(xì)胞RIPK1相對(duì)表達(dá)水平分別為1.000±00.000、0.436±0.106、0.705±0.167、0.625±0.086,總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.190，P=0.001), siRIPK1-1組、siRIPK1-2組、siRIPK1-3組骨肉瘤細(xì)胞RIPK1表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，其中siRIPK1-1組最高，干擾效率最高。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們將采用siRIPK1-1組序列對(duì)骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行干擾。見圖1。

圖1 不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞RIPK1表達(dá)變化

2.2 不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制情況采用CCK-8法檢測(cè)siRIPK1干擾對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干擾24 h后，空白對(duì)照組吸光度值為0.464±0.004，siRIPK1-1組為0.452±0.0051，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.476，P=0.190)；干擾48 h后，2組吸光度值分別為0.925±0.038、0.629±0.027；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.910，P<0.001)；干擾72 h后，2組吸光度值分別為1.517±0.011、0.518±0.034，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=48.960，P<0.001)。這提示siRIPK1-1組能夠顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且具有時(shí)間依賴性。見圖2。

圖2 不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞增殖活性變化

2.3 不同siRIPK1干擾誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡以及壞死性凋亡情況siRIPK1干擾骨肉瘤細(xì)胞后，倒置相差顯微鏡光鏡結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，siRIPK1-1組骨肉瘤細(xì)胞明顯皺縮變形，死亡后漂浮細(xì)胞數(shù)量明顯增加；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(1.44±0.13)%，細(xì)胞壞死率為(4.96±0.96)%；siRIPK1-1組細(xì)胞凋亡率為(17.52±7.68)%，細(xì)胞壞死率為(15.42±3.56)%；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.629，P=0.022；t=4.914，P=0.008)。采用Western blot分析進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組凋亡標(biāo)志性分子Cleaved caspase-3相對(duì)表達(dá)水平為1.000±0.000，siRIPK1-1組為1.633±0.286，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.834，P=0.019)，提示siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞凋亡明顯增加，凋亡參與了骨肉瘤細(xì)胞死亡；空白對(duì)照組壞死性凋亡標(biāo)志性分子p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL相對(duì)表達(dá)水平均為1.000±0.000，而siRIPK1-1組分別為1.764±0.372、1.382±0.146、2.091±0.452,提示siRIPK1干擾后壞死性凋亡也參與了骨肉瘤細(xì)胞死亡。見圖3～5。

圖3 光鏡觀察不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞形態(tài)變化

圖4 流式細(xì)胞儀器檢測(cè)不同siRIPK1干擾后骨肉瘤細(xì)胞凋亡及壞死情況

3 討論

RIPK1是RIPK家族的一員，對(duì)多種決定細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)通路發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，在細(xì)胞死亡和存活中都扮演著重要角色［4-5］。RIPK1一方面通過自身的分子支架功能促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶通路的激活，發(fā)揮抑制細(xì)胞死亡的功能，另一方面其還可以通過激酶作用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。研究［6］發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌患者中RIPK1蛋白水平明顯上調(diào)，并且和腫瘤的惡性程度具有非常好的相關(guān)性，RIPK1可能通過促進(jìn)線粒體的能量代謝促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

骨肉瘤多發(fā)于兒童以及青少年，主要惡性成骨細(xì)胞組成。自從新輔助化療方案引入骨肉瘤的治療方案以來，骨肉瘤的治療效果有了顯著的提高，骨肉瘤患者的5 a生存率可達(dá)到70%。然而目前仍有相當(dāng)一部分患者在接受標(biāo)準(zhǔn)治療后，最終腫瘤還是出現(xiàn)進(jìn)展及惡化，導(dǎo)致骨肉瘤治療遭遇了一直無法突破的瓶頸［7-8］。究其根本原因，關(guān)鍵在于我們對(duì)骨肉瘤的生物學(xué)特征缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。因此，探索對(duì)骨肉瘤生物活性具有重要調(diào)控作用的新靶點(diǎn)迫在眉睫。

本研究結(jié)果顯示：我們應(yīng)用siRIPK1干擾降低RIPK1在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平后，細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制；進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡以及壞死性凋亡標(biāo)志性分子Cleaved caspase-3、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL等表達(dá)水平明顯升高。這提示RIPK1對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞增殖的維持發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

總之，RIPK1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖等生物活性具有重要的調(diào)控作用，是骨肉瘤細(xì)胞維持自身生物活性的必要基因，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外，RIPK1在肝癌、腎癌、肺癌的細(xì)胞系和(或)腫瘤組織中也存在，并促進(jìn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移，這為我們后續(xù)研究提供了一定的借鑒意義［9-10］。