王小兵,付寬寬,顧紅亞,汪曉麗

(1.揚州大學 環(huán)境科學與工程學院,江蘇 揚州 225127;2.江蘇省太倉市浮橋鎮(zhèn)農業(yè)農村服務站,江蘇 太倉 215434)

近年來,隨著農業(yè)結構的不斷調整,我國設施農業(yè)發(fā)展迅速,但設施農業(yè)相對封閉的土壤環(huán)境和人為不合理施肥導致連作障礙越來越嚴重。設施土壤中病原菌大量滋生,土壤微生物中細菌/真菌比逐漸下降,土傳病害越來越嚴重[1]。另外,種植戶往往忽略土壤營養(yǎng)元素之間的平衡,一味追求作物產量而增施氮肥,致使氮肥在土壤中大量積累，從而產生土壤鹽漬化[2]。較高的鹽濃度會抑制作物對水分和養(yǎng)分的吸收,進而引發(fā)作物的生理性干旱[3]。因此土傳病害和土壤次生鹽漬化已成為設施農業(yè)主要的障礙因子。

設施土壤連作障礙治理措施主要包括土壤消毒、利用抗病品種、嫁接技術、輪作倒茬、土壤施肥、化學防治及生物防治等[4-6]。生物防治技術已被證明對許多植物病原菌和害蟲有效[7],因其具有成本低、效率高、不易產生二次污染和環(huán)境友好等優(yōu)點更具有應用前景。近年來,芽胞桿菌在生物防治中的應用受到了廣泛的關注。芽胞桿菌能增強作物對病害的控制,誘導作物防御病害,同時能刺激作物生產和合成1-氨基環(huán)丙烷-羧酸脫氨酶(ACC)活性和激素,促進作物生長和養(yǎng)分吸收,提高作物的抗氧化能力[8]。Wang等[9]分離并發(fā)現(xiàn)了枯草芽胞桿菌BSN-1能夠抑制土壤中磷酸鹽的結晶,可以有效減輕土壤鹽漬化的危害。

響應面方法是生物學中一種重要的優(yōu)化方法,在發(fā)酵工藝優(yōu)化中應用相當廣泛。Khan等[10]通過響應面法優(yōu)化了芽胞桿菌菌株MS07的培養(yǎng)基以提高抗菌肽的產量。蘇同偉等[11]通過響應面法優(yōu)化了海洋微生物霉菌的培養(yǎng)條件,在培養(yǎng)時間為 9 d、誘導物添加量為 0.5%、培養(yǎng)溫度為 28 ℃的條件下,產量可達 1 978.33 mg/L。

通過單一生防菌防治設施連作障礙的研究報道較多[12-16],但用單一生防菌防治設施連作障礙在防治范圍上具有一定的局限性,而復合生防菌不僅有更大的防治范圍，而且在其共生產物中的活性物質也往往具有特殊的防治效果[17]。然而目前復合菌劑生產基本上采用單菌株發(fā)酵培養(yǎng)方式,而對多菌株共培養(yǎng)的研究較少[18-19]。

本課題組在前期篩選了2株芽胞桿菌,其中1株解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BZ6-1對花生青枯病菌等病原細菌，以及水稻紋枯病菌和稻瘟菌等病原真菌均有較強的抑制作用,具有較廣的抗菌譜[20-21]。另1株短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)SC-12能生產吲哚乙酸(IAA)，并具有顯著的耐鹽[22]和促生作用[23]。前期研究已證明菌株BZ6-1與SC-12之間沒有拮抗作用,可以進行共培養(yǎng)[24]。本研究以短小芽胞桿菌SC-12和解淀粉芽胞桿菌BZ6-1為研究對象,采用單因素和響應面試驗法優(yōu)化了復合芽胞桿菌的共培養(yǎng)條件,并使用100 L發(fā)酵罐進行了發(fā)酵工藝的驗證試驗,以期獲得具有高有效活菌數和高經濟效益的復合芽胞桿菌菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株分別為解淀粉芽胞桿菌BZ6-1(保藏編號:CGMCC No.2892)和短小芽胞桿菌SC-12(保藏編號:CGMCC No.7622)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 L, pH 7。LB液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉5 g、去離子水1 L, pH 7。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉4 g、磷酸氫二鉀0.5 g、硫酸鎂0.2 g、氯鉀鈣1 g、去離子水1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 將BZ6-1菌株從-70 ℃取出,接種于LB固體培養(yǎng)基,在35 ℃下培養(yǎng)24 h后挑取1環(huán)菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,在35 ℃和150 r/min轉速條件下培養(yǎng)24 h,制備BZ6-1菌株的種子液，使其濃度為1×108cfu/mL。將SC-12菌株從-70 ℃取出，接種于LB固體培養(yǎng)基,在35 ℃下培養(yǎng)24 h后挑取1環(huán)菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,在35 ℃和150 r/min轉速條件下培養(yǎng)24 h,制備SC-12菌株的種子液，使其濃度為1×108cfu/mL。取100 μL BZ6-1菌株種子液和100 μL SC-12菌株種子液于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，在35 ℃和150 r/min轉速條件下培養(yǎng)24 h,制備BZ6-1菌株和SC-12菌株的共培養(yǎng)發(fā)酵液,使其濃度為1×108cfu/mL。

1.2.2 菌量測定 采用平板菌落計數法[25],通過梯度稀釋計算菌落數。

1.2.3 單因素試驗 以兩種菌株比例1∶1、接菌量2%(v/v)、pH 7、轉速150 r/min、培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時間24 h為固定值。按照單因素試驗依次改變變量,將菌株SC-12和菌株BZ6-1的比例設為1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、1∶2、1∶5、1∶10(v/v);接種量設為1%、2%、5%、10%(v/v); pH值設為6、7、8、9;搖床轉速設為80、120、160、200 r/min;培養(yǎng)溫度設為25、30、35、40 ℃;培養(yǎng)時間設為8、12、16、20、24、28、32 h。取150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基在250 mL的三角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.4 采用響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件 通過Desgin-Exper 8.0.6 軟件進行Plackett-Burman試驗并確定影響共培養(yǎng)的重要因子，再以得到的重要因子為基礎設計最陡爬坡路徑試驗。最陡爬坡試驗第1組條件是接種量2%、pH 7、轉速120 r/min;第2組條件是接種量3.5%、pH 7.5、轉速140 r/min;第3組條件是接種量5%、pH 8、轉速160 r/min;第4組條件是接種量6.5%、pH 8.5、轉速180 r/min。

根據最陡爬坡試驗結果,以接種量 3.5%、pH 7.5、轉速 140 r/min為中心點設計試驗,以復合菌菌落數為響應值,設計三因素三水平的響應面試驗。影響發(fā)酵條件的三因素三水平設計為接種量(2.0%、3.5%、5.0%)、pH值(7.0、7.5、8.0)、轉速(120、140、160 r/min),共計17組試驗處理。利用Design-Expert 8.0.6軟件,進行Box-Behnken中心組合設計并進行響應面分析[26]。

1.2.5 發(fā)酵罐驗證試驗 使用100 L的發(fā)酵罐進行優(yōu)化發(fā)酵條件和原始發(fā)酵條件兩個處理試驗,優(yōu)化發(fā)酵處理即在發(fā)酵培養(yǎng)基上以最優(yōu)條件[SC-12菌株與BZ6-1菌株菌落數比2∶1(v/v)、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間16 h、接種量3%、轉速132 r/min、pH 7.6]進行發(fā)酵;原始發(fā)酵處理即在發(fā)酵培養(yǎng)基上以SC-12菌株與BZ6-1菌株菌落數比1∶1(v/v)、溫度35 ℃、培養(yǎng)時間24 h、接種量2%、轉速150 r/min、pH 7進行發(fā)酵。在發(fā)酵處理結束后，從發(fā)酵罐中取樣至無菌離心管中,以平板計數法測定濾液菌落數。

1.2.6 數據統(tǒng)計與分析 采用 Microsoft Office Excel 2016 軟件進行數據統(tǒng)計，用SPSS statistics 21軟件進行數據統(tǒng)計分析，用Origin 8.5軟件進行圖片繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素優(yōu)化試驗

單因素優(yōu)化試驗結果見圖1。當接種量為2%、5%時,兩種芽胞桿菌的菌落數較多,且與1%接種量的菌落數差異顯著；當接種量為5%時,菌落數達到峰值2.71×108cfu/mL。當pH值為7和8時,兩種芽胞桿菌的菌株生長旺盛,菌落數居前2位且與其它處理差異顯著；當pH值為8時SC-12菌株和BZ6-1菌株的菌落數達到峰值2.72×108cfu/mL；當pH值為7時兩種菌株的菌落數為2.42×108cfu/mL。當轉速為160 r/min時,菌落數達到峰值7.60×108cfu/mL。當SC-12菌株和BZ6-1菌株的比例為2∶1時,菌落數達到峰值4.36×108cfu/mL,顯著高于其他處理。當溫度為30 ℃時,SC-12菌株和BZ6-1菌株的菌落數達到峰值6.60×108cfu/mL,且與其它處理差異顯著。當發(fā)酵時間為16 h時菌落數達到峰值1.17×108cfu/mL,且與其它處理差異顯著。

柱狀圖上標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 Plackett-Burman共培養(yǎng)發(fā)酵試驗

根據共發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素試驗結果,利用Design-Expert 8.0.6軟件進行Plackett-Burman試驗設計,見表1。對共培養(yǎng)的條件因子進行顯著性分析,結果(表2)顯示:該模型的P=0.0055,在0.01水平上顯著,因此該模型的可信度高于99%；因素A(接種量)的P=0.0414，因素B(pH值)的P=0.0267，因素C(轉速)的P=0.0469，可信度均高于95%,說明上述3個因素對復合芽胞桿菌的菌落數有顯著的影響，且影響程度表現(xiàn)為pH值>接種量>轉速；其余因素對復合芽胞桿菌的菌落數的影響不大。因此,選擇上述3個因素進行下一步的試驗。

表2 共培養(yǎng)因素的效應值及方差分析結果

2.3 最陡爬坡路徑試驗

根據單因素優(yōu)化實驗結果進行最陡爬坡路徑試驗設計(見表3)。結果表明當接種量為3.5%、pH值為 7.5、轉速為140 r/min時復合芽胞桿菌的菌落數最多,達到9.20×108cfu/mL。因此選擇這個點為響應面試驗的中心點。

表3 最陡爬坡路徑試驗設計及結果

2.4 響應面法優(yōu)化試驗

以兩種芽胞桿菌的菌落數為響應值,對表4中的試驗數據進行回歸分析,得到下列二次多項回歸方程：菌落數=10.72+0.15A+2.16B-0.36C-0.47AB+1.73AC-0.40BC-1.69A2-3.01B2-1.76C2，該方程的相關系數R2=0.9168,說明該方程的擬合程度好，可以對試驗結果進行預測。

表4 響應面試驗編碼方案與試驗結果

由表5的方差分析結果可知：模型的F=8.57,P=0.0049<0.0100，說明該回歸方程是極顯著的；擬失項不顯著(P=0.7100>0.05),說明該回歸方程具有較高的可信度；模型的相關系數R2=0.9168,說明該模型能夠解釋91.68%的變化；模型的一次項B及二次項B2影響極顯著(P<0.01)；二次項A2、C2以及交互項AC影響顯著(P<0.05)。

表5 菌株菌落數的回歸模型方差分析結果

不同培養(yǎng)條件對復合芽胞桿菌菌落數影響的響應面圖和等高線圖見圖2。等高線圖可以準確地反映接種量、pH值和轉速之間的交互影響,如果等高線為橢圓形則代表其交互作用較顯著；如果等高線為圓形則相反[27]。從圖2中可以看出：接種量和轉速的等高線為橢圓形,說明其對復合芽胞桿菌菌落數的交互作用顯著,符合方差分析中交互項AC影響顯著(P<0.05)的結果；pH值和接種量、pH值和轉速的等高線均為圓形,說明其對復合芽胞桿菌菌落數的交互作用不顯著；固定接種量、pH值、轉速中的任一因素,復合芽胞桿菌的菌落數會隨著另一個因素的升高而升高,說明轉速和接種量、pH值和接種量、pH值和轉速都可以找到極值點。從回歸方程可知，SC-12菌株和BZ6-1菌株共發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件:SC-12菌株與BZ6-1菌株的菌落數比為2∶1；培養(yǎng)溫度為30 ℃；培養(yǎng)時間為16 h；接種量為3%；轉速為132 r/min；pH值為7.6。

A為接種量/%; B為pH值; C為轉速/(r/min); Y為菌落數/(×108 cfu/mL)。

2.5 優(yōu)化后共發(fā)酵的效果

在優(yōu)化共發(fā)酵后,芽胞桿菌的菌落數相較于原始發(fā)酵的菌落數有了顯著的提升:在原始發(fā)酵條件下芽胞桿菌的菌落數只有7.90×108cfu/mL，而在優(yōu)化發(fā)酵條件后芽胞桿菌的菌落數達到了11.00×108cfu/mL,后者比前者提升了39.20%。

2.6 發(fā)酵罐試驗驗證

在100 L發(fā)酵罐中以響應面法優(yōu)化預測的共培養(yǎng)條件對復合菌株進行擴大培養(yǎng)驗證試驗,結果如圖4所示。在發(fā)酵罐中優(yōu)化發(fā)酵的菌落數達到了10.30×108cfu/mL,而原始發(fā)酵的菌落數只有7.20×108cfu/mL,前者比后者提升了43.00%。該驗證值與預測值吻合度高,表明響應面分析法可應用于優(yōu)化共培養(yǎng)發(fā)酵試驗[28]。

發(fā)酵條件

發(fā)酵條件

3 討論與結論

生物菌劑通過改良土壤生物環(huán)境來抑制致病菌,提高土壤養(yǎng)分的有效性,從而有效控制設施土壤連作障礙。Laura等[29]利用芽胞桿菌XT1 CECT 8661對設施蔬菜灰霉病進行了防治；王紅麗等[30]通過復合接種枯草芽胞桿菌GLB191 和短小芽胞桿菌GLB197提高了對葡萄灰霉病菌的抑病率；吳忠紅等[31]研究了耐鹽促生細菌Rs-198與Rs-5混合培養(yǎng)提高作物耐鹽性以及促進作物生長的效果。前人研究的生物菌劑基本上以單一菌劑或單一功能混合菌劑為主,而本研究的菌劑是具有耐鹽、促生和抗病等多重作用的復合菌劑,為今后多功能復合菌劑的研發(fā)提供了理論依據。

影響微生物發(fā)酵的因素包括培養(yǎng)基組分以及溫度、pH值、溶氧、接種量等發(fā)酵條件[32]。王建等[33]通過采用響應面法優(yōu)化復合乳酸菌的培養(yǎng)條件,將菌落數對數值從6.93提高到9.79。本文通過采用單因素優(yōu)化、Plackett-Burman試驗和響應面分析等方法對復合芽胞桿菌的共培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后,芽胞桿菌的菌落數有了顯著的提升,達到了11.00×108cfu/mL,比未優(yōu)化前的芽胞桿菌的菌落數提升了39.20%，表明通過優(yōu)化微生物的共培養(yǎng)條件可以顯著提高復合芽胞桿菌的菌落數量。

不同培養(yǎng)條件對微生物共培養(yǎng)發(fā)酵的影響程度均有不同。李佳娣等[34]優(yōu)化了殺線蟲解淀粉芽胞桿菌Sneb709與費氏中華根瘤菌Sneb183的共培養(yǎng)發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)影響發(fā)酵效果的5個培養(yǎng)條件的順序為溫度>pH值>裝液量>時間>轉速。本研究發(fā)現(xiàn)影響復合芽胞桿菌菌落數的主要因子是pH值、接種量和轉速,而且影響程度表現(xiàn)為pH值>接種量>轉速,這可能與不同微生物具有不同的生長特性有關。

本研究發(fā)現(xiàn)通過采用響應面法優(yōu)化復合芽胞桿菌的共培養(yǎng)條件，可以顯著提升復合芽胞桿菌的菌落數。但今后尚需進一步明確復合芽胞桿菌在共培養(yǎng)后的活性物質產出情況,以期為防治設施農業(yè)次生鹽漬化和土傳病害提供理論依據。

本研究通過單因素優(yōu)化、Plackett-Burman試驗和響應面分析等方法確定了復合芽胞桿菌的最適共培養(yǎng)條件:SC-12菌株與BZ6-1菌株的菌落數比為2∶1(v/v)；培養(yǎng)溫度為30 ℃；培養(yǎng)時間為16 h；接種量為3%(v/v)；轉速為132 r/min；pH值為7.6。以優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行共培養(yǎng)，得到的菌落數為11.00×108cfu/mL,比原始發(fā)酵的菌落數增加了39.20%。在100 L發(fā)酵罐中的菌落數達到10.30×108cfu/mL,比原始發(fā)酵的菌落數增加了43.00%。本次試驗探索了不同培養(yǎng)條件對復合芽胞桿菌共培養(yǎng)菌落數的影響,得到了最佳共培養(yǎng)條件,同時在放大發(fā)酵試驗中得到了驗證。本研究結果可為具有高有效活菌數和高經濟效益的復合芽胞桿菌菌劑生產提供理論依據,為生物防治設施農業(yè)次生鹽漬化和土傳病害提供技術支撐。